على في المختبر إعداد الخلايا العصبية المعوية المعزولة والدبقية من الضفيرة العضلية المعوية من الماوس الكبار

الهدف العام من هذا الإجراء هو عزل الخلايا العصبية القابلة للحياة وظيفيا و CLIA من الضفيرة العضدية المعوية للفأر البالغ. يتم تحقيق ذلك عن طريق طلاء سطح زراعة الخلايا المعقمة أولا بالبولي ليسين واللامينين. الخطوة الثانية هي تحضير المحاليل والمنطقة الجراحية لعزل الضفيرة العضلية المعوية.

بعد ذلك ، قم بإزالة الجهاز الهضمي وعزل القسم المطلوب لإنشاء إعداد الضفيرة العضعية المعوية الطولية. تتمثل الخطوة الأخيرة في هضم LMMP بالتتابع في الكولاجيناز والتربسين ، متبوعا بطلاء الخلايا على أسطح زراعة الخلايا المشفرة مسبقا. في النهاية ، يمكن استخدام الفيزيولوجيا الكهربية وكيمياء السيتو المناعية وتفاعل البوليميراز المتسلسل أحادي الخلية لدراسة تأثيرات الخلايا العصبية المعوية أو الخلايا الدبقية أو التفاعل بين هذين النوعين من الخلايا.

ستظهر الإجراء الدكتورة تريشا هار سميث ، زميلة ما بعد الدكتوراه في جميع المختبرات ، وستكون جوي جومبي ، مرشحة الدكتوراه في جميع المختبرات ، مساعدتها الميزة الرئيسية لهذه التقنية على التقنيات الحالية هي أن الخلايا العصبية والخلايا الدبقية تأتي من الفأر البالغ. هذا يسمح للخلايا العصبية والخلايا الدبقية التي تعمل بكامل طاقتها ، والتي يمكن أن تأتي من المعدلة وراثيا.

على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة على الخصائص الكهربائية للخلايا العصبية. يمكن أيضا تطبيقه على منهجيات أخرى مثل كيمياء السيتو المناعية ، وتفاعل البوليميراز المتسلسل أحادي الخلية ، وتصوير الكالسيوم في الوقت الفعلي. ابدأ هذا الإجراء بوضع فأر قتل رحيم في الظهر الراقد على سطح الجراحة.

بعد ذلك ، نظف جلد البطن بنسبة 70٪ من الإيثانول. ثم ارفعه بزوج من الملقط وافتح تجويف البطن بالمقص للكشف عن الجهاز الهضمي الداخلي. بعد ذلك ، ارفع جزءا من الدقاق للكشف عن المساريق.

قم بإزالة الجهاز الهضمي وقص المساريق بالمقص. ثم قم بإزالة وكشف الدقاق والقولون برفق. احرص على عدم سحب المساريق من الدقاق والقولون بعد تفكيك الأمعاء كاملة الطول.

قم بإزالة الدقاق عن طريق قطع الأمعاء البعيدة عن المعدة والقريبة من الأعور. يمكن أيضا إجراء هذا الإجراء باستخدام نسيج القولون عن طريق إزالة القولون من البعيد إلى الأعور إلى القريب من فتحة الشرج. بعد ذلك ، قسم الدقاق إلى ثلاث قطع كبيرة أو أكثر.

افركي محلول الكريب برفق من خلال قسم الأمعاء حتى تتم إزالة كل البراز في حاوية نفايات منفصلة. ضع القسم النظيف في حاوية كريبس المسمى نظيفة وكرر الإجراءات حتى يتم تنظيف الدقاق بالكامل. لإزالة LMMP ، قم بتقطيع الدقاق إلى أجزاء صغيرة من سنتيمترين إلى أربعة سنتيمترات.

بعد ذلك ، ضع جزءا من الدقاق على قضيب بلاستيكي أو زجاجي. يجب أن يكون الدقاق مناسبا بشكل مريح ولكن ليس فضفاضا أو مشدودا. امنع الجهاز الهضمي من الدوران حول القضيب عن طريق تثبيت الأنبوب برفق على القضيب بالإبهام.

ثم قم بإزالة أجزاء المساريق التي لا تزال متصلة بالجهاز الهضمي باستخدام ملقط. بعد ذلك ، افصل LMMP عن العضلة الدائرية الأساسية. عن طريق فرك حافة الملقط برفق على طول الخط بأكمله حيث تم ربط المساريق من أعلى إلى أسفل الجزء.

بعد ذلك ، قم بإنشاء فجوة برفق في العضلات الطولية. ثم قم بإزالة العضلات الطولية برفق باستخدام قطعة قطن مربوطة بأسطوانات تبدأ من الجزء العلوي من الفجوة ، باستخدام أخف ضربة أفقية مع تطبيق ضغط خفيف جدا حتى تبدأ العضلة الطولية في الانفصال عن العضلة الدائرية. افعل ذلك أسفل الشريط بأكمله على طول نقطة التعلق المتوسطة.

بعد ذلك ، اعمل برفق حول أنبوب الجهاز الهضمي عن طريق التحرك من أعلى إلى أسفل وللخلف. حيث يتم فصل العضلة الطولية ببطء عن العضلة الدائرية على طول الطريق حول الأنبوب. عند اكتماله ، سيخرج LMMP بشكل طبيعي من أنبوب الجهاز الهضمي المتبقي.

ثم ضع الشريط الرفيع الناتج من العضلات الطولية في الدورق المسمى LMMP وكرر الإجراءات لجميع الأجزاء في هذا الإجراء. ضع الشطف على شرائح LMMP في محلول الهضم. ثم قص LMMP إلى قطع صغيرة بالمقص.

بعد ذلك ، هضمها لمدة 60 دقيقة. في حمام مائي 37 درجة مئوية مع شاكر أثناء فقاعات الكربوجين برفق. بعد اكتمال عملية الهضم ، اجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي لمدة ثماني دقائق عند 356 جيجابايت في جهاز طرد مركزي ، تبرد إلى أربع درجات مئوية.

في غضون ذلك ، قم بإعداد محلول التربسين بنسبة 0.05٪ في غطاء مزرعة الخلايا عن طريق إضافة مليلتر واحد دافئ 0.25٪ تريبسين وأربعة ملليلتر من HBSS دافئ في أنبوب زراعة خلية معقم سعة 50 ملليلتر. بعد الطرد المركزي ، تخلص من المادة الطافية ، وقم بإزالة حبيبات الخلية بعناية وضعها في أنبوب نظيف بخمسة ملليلتر من محلول tryin بنسبة 0.05٪. بعد ذلك ، قم بهضم الخلايا في محلول tryin بنسبة 0.05٪ في حمام مائي 37 درجة مئوية مع الرج لمدة سبع دقائق ، وقم بتحييد tryin باستخدام 10 مل من وسائط الشطف البارد.

بعد سبع دقائق من العلاج بالتريبسين ، قم بالطرد المركزي للخلايا لمدة ثماني دقائق عند 356 جراما. في غضون ذلك ، قسم التوازن لشبكة TX المعقمة أعلى أنبوب ثقافة الخلايا المعقم سعة 15 مل. بعد الطرد المركزي ، تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق خليط الخلية برفق عن طريق تشغيله في ثلاثة ملليلترات.

وسائط الخلايا العصبية الكاملة. يجب إجراء جميع التعديلات برفق شديد لتجنب توليد فقاعات الهواء ، قم بتصفية محلول الخلية من خلال شبكة NYX في أنبوب ثقافة خلية نظيف سعة 15 مل. اجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي لمدة ثماني دقائق عند 356 جم.

بعد ذلك ، قم بإزالة المادة الطافية والتخلص منها. إعادة تعليق الخلايا في 1200 ميكرولتر وسائط الخلايا العصبية الكاملة. بعد ذلك ، قم بعمل الخلايا برفق باستخدام طرف ماصة بلاستيكية سعة مليلتر واحد.

احرص على عدم توليد فقاعات هواء: ماصة ببطء ولطف حتى تتفكك معظم القطع وتعلق الخلايا إلى سائل. الآن ، أضف 750 ميكرولترا من الوسائط الكاملة إلى كل بئر من الآبار ال 12 التي تحتوي على زلة غطاء زجاجي مشفرة مسبقا. ثم أضف 100 ميكرولتر من محلول الخلية المقدر.

احتضان الخلايا العصبية في حاضنة زراعة الخلايا عند 37 درجة مئوية مع تغيير ثاني أكسيد الكربون بنسبة 5٪. نصف الوسائط الخلوية كل يومين. الخلايا العصبية جاهزة للتسجيلات الفيزيولوجية الكهربية بعد يوم إلى يومين في الثقافة.

يظهر هنا التوصيف الكيميائي المناعي للخلايا العصبية المعوية. ليا معزولة من الفأر. كشف الفحص المجهري متحد البؤر للعضلات الطولية عن تلطيخ بيتا ثلاثة توبولين العصبي في تحضير العضلات اللفائفي الطولية بالكامل من الفأر.

وهذه هي الخلايا المعزولة من مستحضرات LMMP ، والتي تحتوي على الخلايا العصبية التي تم تلطيخها بشكل إيجابي لربط السعرات الحرارية وخلايا Retin الدبقية الموضحة هنا تم تصورها باستخدام علامة الدبقية الخاصة GFAP. ومع ذلك ، لم يلاحظ أي تلطيخ عند حذف الجسم المضاد الأولي. فيما يلي الخلايا العصبية والخلايا الدبقية المعزولة عن العضلة الطولية للفأر التي تنمو على مقربة من بعضها البعض.

تشير صور الفحص المجهري متحد البؤر إلى أن الخلايا العصبية الخضراء و ggl الأحمر تنمو بسهولة بجوار بعضها البعض ويبدو أنها تتفاعل في المختبر. يوضح هذا الشكل الفيزيولوجيا الكهربية للخلايا العصبية المعوية المستنبتة و CLIA في وضع المشبك الحالي. أظهرت جميع الخلايا العصبية إمكانات العمل عند الحقن الحالي.

تحتوي CLIA على إمكانات فعل ، ولكنها تعرض إمكانات كهربية كبيرة استجابة للحقن الحالي. الخلايا العصبية المزروعة من دقاق الفأر هي مجموعة غير متجانسة من الفيزيولوجيا الكهربية. في وضع المشبك الحالي ، يؤدي الحقن الحالي البالغ 0.09 نانو أمبير في الخلايا العصبية إلى إمكانات عمل.

تعود الخلايا العصبية السلبية HP على الفور إلى إمكانات غشاء الراحة بعد التحفيز. بينما تعرض الخلايا العصبية الإيجابية HP A HP بعد التحفيز الذي ينخفض فيه إمكانات الغشاء المريح إلى ما دون خط الأساس قبل العودة ببطء إلى القيمة الأولية. بمجرد إتقانها ، يمكن القيام بهذه التقنية في غضون أربع ساعات إذا تم إجراؤها بشكل صحيح.

عند محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر الحفاظ على الأواني الزجاجية والأدوات الجراحية نظيفة قدر الإمكان. قم أيضا بتكرار الخلايا وفقاعات برفق وتغيير نصف وسائط زراعة الخلايا كل يومين بعد هذا الإجراء. يمكن إجراء طرق مثل الفيزيولوجيا الكهربية وكيمياء السيتو المناعية من أجل الإجابة على أسئلة إضافية مثل كيفية استجابة القنوات الأيونية في الأمعاء للعلاج الدوائي ، والتعرف على التعبير عن البروتينات في الخلايا العصبية والليا ، وكيف يتم تغيير تفاعل هذين النوعين من الخلايا من خلال علاجات مختلفة بعد تطورها.

مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال علم الأعصاب لاستكشاف الوظائف الأساسية للاعتلال العصبي والاعتلالات العصبية g للجهاز العصبي المعوي في المعدلة وراثيا. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية عزل الخلايا العصبية والخلايا الدبقية من الضفيرة TER للجهاز العصبي المعوي للفأر البالغ.