العزلة والتمايز TH17 من السذاجة CD4 T الخلايا اللمفاوية

الهدف العام من هذا الإجراء هو التمييز بين خلايا TH 17 من الخلايا الليمفاوية التائية الإيجابية الساذجة. يتم تحقيق ذلك عن طريق حصاد الغدد الليمفاوية والطحال أولا من فأر بالغ C 57 أسود سداسي. في الخطوة الثانية ، يتم طحن الأنسجة للحصول على معلق خلية واحدة.

يتم عزل الخلايا التائية السالبة الأربعة CD 25 الإيجابية وزراعتها في ظل TH 17 التي تحفز أو تنشط ظروف التحكم فيها. في النهاية ، يمكن استخدام Q-P-C-R-E-I-S-A وقياس التدفق الخلوي لتقييم تعبير IL 17 A. لذلك يمكن أن توفر هذه الطريقة نظرة ثاقبة لتمايز الخلايا الليمفاوية التائية الأربعة إلى T ثمانية 17 خلية في C 57 ستة فئران سوداء.

يمكن أيضا تطبيقه على طرازات الماوس الأخرى أيضا. يعد عرض هذه الطريقة أمرا بالغ الأهمية لأن الغدد الليمفاوية صغيرة جدا ، مما يجعل خطوات التشريح صعبة. بدون تصور مباشر لهذه الطريقة ، قبل أربع ساعات على الأقل من إضافة الخلايا ، قم بتغطية آبار لوحة زراعة أنسجة الاختبار الدقيقة الجديدة 96 بئر UBO مع 30 ميكرولترا من المضادة للقرص المضغوط المخففة ثلاثة مخففة في PBS معقمة ، انقر على جوانب اللوحة لضمان تغطية موحدة للآبار ثم احتضان اللوحة عند 37 درجة مئوية بعد أربع ساعات ، ضعي الطبق في الثلاجة حتى يحين وقت إضافة الخلايا.

بعد تأكيد الوفاة بسبب خلع عنق الرحم ، قم بتعقيم منطقة الشق على فأر بالغ C 57 أسود ستة مع 70٪ من الإيثانول. ثم أمسك الجلد الأمامي لفتحة مجرى البول واقطع من خط الوسط البطني إلى منطقة الذقن ، مع الحرص على عدم إزعاج الصفاق. بعد ذلك ، قم بتثبيت الجلد للسماح بالوصول إلى الغدد الليمفاوية والطحال لإزالتها.

الآن قم بإزالة الغدد الليمفاوية الإبطية الموجودة بالقرب من إبط الفأر خلف العضلات الصدرية وضع الأنسجة في طبق بتري يحتوي على خمسة ملليلتر من عازلة تشغيل AutoMax. ثم قم بإزالة الغدد الليمفاوية العضدية الموجودة في النسيج الضام بالقرب من كل إبط. بعد ذلك ، قم بإزالة الغدد الليمفاوية العنقية السطحية الموجودة في عنق ، وتحيط بالقصبة الهوائية ، ثم قم بإزالة الغدد الليمفاوية الأربية الموجودة في منطقة الورك عند اقتران الأوعية الدموية الثلاثة.

للوصول إلى الغدد الليمفاوية المساريقية ، قم أولا بقطع خط الوسط البطني من خلال البطانة الصفاقية. تقع الغدد الليمفاوية المساريقية في عمق المساريق ، بشكل عام في سلسلة من أربع إلى ثماني عقد قد تظهر على شكل سلسلة من اللؤلؤ. قم بإزالة الطحال وسحبه وفصله عن البنكرياس.

ثم ضعه في طبق بتري مع الغدد الليمفاوية لطحن الأعضاء. ضع الغدد الليمفاوية على الجانب المتجمد من شريحة مجهرية واحدة ثم افرك الأنسجة بالجانب المتجمد من شريحة ثانية. لتصفية الأعضاء الأرضية في معلق خلية واحدة ، قم أولا بطي قطعة ما يقرب من ثلاث بوصات في ثلاث بوصات من مادة النايلون 40 ميكرون عدة مرات وضعها في الجزء العلوي من أنبوب الطرد المركزي سعة 15 ملليلترا.

استخدم حقنة سعة خمسة ملليلتر مزودة بإبرة قياس 21 لشفط الخلايا والتخزين المؤقت ثم توزيع محلول الخلية ببطء في النايلون المطوي. الحرص على تجنب ثقب المادة بالإبرة. بمجرد تحقيق تعليق خلية واحدة ، يجب أن يبدو المحلول متسقا مع عدم وجود قطع مرئية من الأنسجة الصلبة.

ضع هذا المحلول على الجليد. بعد فرز الخلايا عن طريق فصل AutoMax إلى 80٪ على الأقل من نقاء الخلايا السلبية بأربعة CD 25 سلبية. عد الخلايا عن طريق استبعاد ثلاثي أزرق ثم قم بتخفيف تعليق الخلية إلى واحد في 10 إلى الخلايا الست لكل مليلتر في وسط زراعة الخلايا.

الآن شطف جميع آبار اللوحة المضادة للقرص المضغوط الثلاثة مع 200 ميكرولتر من PBS. كل منها يتخلص من الغسيل في حاوية نفايات. ثم أضف 100 ميكرولتر من مزيج TH 17 المحفز للكتيل أو التحكم في التنشيط إلى الآبار المناسبة في ثلاث نسخ.

أخيرا ، أضف 100 ميكرولتر من الخلايا إلى كل بئر واحتضان الخلايا لمدة 72 ساعة على الأقل أو حتى خمسة أيام لتحقيق تمايز خلايا TH 17 ل Eli SA و QPCR. بعد فترة الحضانة ، قم بتجميع ثلاث نسخ من كل عينة في أنابيب einor فردية. بعد تدوير الخلايا ، انقل المادة الطافية إلى أنابيب einor منفصلة وخزنها عند درجة حرارة 20 درجة مئوية تحت الصفر لقياس إنتاج IL 17 A لاحقا بواسطة ELI.

A.To الاستعداد ل QPCR بعد إزالة التعليق الطافي ، الكريات المتبقية في 175 ميكرولتر ، مخزن تحلل الحمض النووي الريبي لاستخراج الحمض النووي الريبي الفوري أو تخزينه عند 80 درجة مئوية تحت الصفر حتى تصبح جاهزة لبدء الإجراء بعد فترة الحضانة. استعدادا لتنشيط الخلية قبل IL 17 ، يتم تلطيخ كل من خلية التحكم في TH 17 المحفزة أو التنشيط ثلاث مرات في آبار فردية من لوحة ثقافة خلية 24 بئر. أضف 400 ميكرولتر من وسط زراعة الخلايا إلى كل بئر.

لرفع الحجم الإجمالي إلى مليلتر واحد ، أضف أيون PMA mycin و felden A إلى كل بئر واحتضان الخلايا لمدة أربع ساعات عند 37 درجة مئوية للكشف عن وجود IL 17 A عن طريق التلوين داخل الخلايا وقياس التدفق الخلوي. أولا ، انقل الخلايا من كل بئر من صفيحة 24 بئر إلى أنبوب أينور منفصل. ثم قم بتدوير الأنابيب.

قم بإزالة المواد الطافية وإعادة تعليق كريات الخلية في 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت للفاكس. انقل الخلايا المعلقة إلى لوحة قياس التدفق الخلوي 96 بئر وقم بتدوير الخلايا مرة أخرى بعد غسل الكريات في 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت للفاكس ، وأعد تعليق الخلايا في 100 ميكرولتر من مخزن الفاكس المؤقت وأضف 100 ميكرولتر من خليط تلطيخ الأجسام المضادة خارج الخلية. احتضن لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة بعيدا عن الضوء.

بعد غسل الخلايا مرتين ، احتضن الكريات في 100 ميكرولتر من خلايا BD. قم بإصلاح عازلة cyto perm المغطاة بورق الألمنيوم لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. الآن اغسل الخلايا مرتين في 100 ميكرولتر من مخزن غسيل X BD perm ، ثم احتضن الخلايا في 50 ميكرولترا من خليط الأجسام المضادة داخل الخلايا المغطى بورق الألمنيوم لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.

بعد غسل الخلايا مرة أخرى ، قم بتعليق الخلايا في 200 ميكرولتر من مخزن تلطيخ BD ، ثم انقل الخلايا إلى أنابيب قياس التدفق الخلوي التي تحتوي على 200 ميكرولتر من مخزن تلطيخ. قم بتخزين الأنابيب عند أربع درجات مئوية حتى تصبح جاهزة للقراءة لتحليل قياس التدفق الخلوي للعينات البوابة الأولى على مجموعة الخلايا الحية. بعد ذلك ، استخدم مجموعة الخلايا الحية لبوابة القرص المضغوط أربعة موجبين من القرص المضغوط ثمانية سلبيين.

أخيرا من القرص المضغوط أربعة إيجابي CD ثمانية مشية سكانية سلبية على IL 17 مجموعة إيجابية للتمييز بين خلايا TH 17 ، يجب إثراء خلايا العقدة الليمفاوية والطحال غير المجزأة للقرص المضغوط أربعة خلايا تائية سلبية CD 25. في هذا الشكل ، تظهر خلايا العقدة الليمفاوية المجمعة غير المجزأة ، وخلايا SP و AutoMax ، وكسور خلايا TT المنفصلة الملطخة ب anti CD four و anti CD 25. تظهر مخططات المبعثر الأولى هذه ملفا تمثيليا للنسبة المئوية للخلايا الليمفاوية الإيجابية الأربعة ، و CD 25 الإيجابية و CD الأربعة الإيجابية CD 25 الخلايا الليمفاوية السلبية الموجودة في الغدد الليمفاوية المجمعة غير المجزأة وخلايا الطحال.

يوفر إجراء العزل أيضا مجموعة CD موجبة CD 25 موجبة يمكن استخدامها في تجارب إضافية. في مخطط التشتت النهائي هذا ، يتم عرض إثراء الخلية المطلوب بمجموعة سكانية تبلغ 84٪ CD أربعة خلايا تائية سالبة CD 25. يساعد هذا القرص المضغوط المخصب بأربعة خلايا تائية سلبية CD 25 على ضمان تمايز TH 17 أكثر نجاحا كما هو موضح في هذا الشكل.

في حين أن حضانة الخلايا الليمفاوية التائية الإيجابية CD 25 الإيجابية CD 25 مع مضاد CD ثلاثة ومضاد CD 28 لمدة خمسة أيام ينتج عن CD 25 حضانة الخلايا الليمفاوية التائية الإيجابية تحت ظروف تحفيز TH 17 ينتج مجموعة فرعية من IL 17 تنتج CD أربعة خلايا ليمفاوية إيجابية CD 25. يمكن تقييم حالة التمايز TH 17 بشكل أكبر من خلال تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي و Elis A هنا تظهر البيانات من القرص المضغوط المخصب أربعة خلايا ليمفاوية تائية سلبية CD 25 المحتضنة تحت السيطرة أو TH 17 الحالات المحفزة للقرص المضغوط أربعة إيجابية. CD 25 الخلايا الليمفاوية التائية السلبية المحتضنة تحت ظروف TH 17 تنظم IL 17 A ، والتي يمكن التحقق منها من خلال QPCR و ELI SA. يتم أيضا تنظيم عامل النسخ المحدد TH 17 ROAR gamma T بواسطة CD أربعة خلايا تائية سلبية CD 25 موجبة محتضنة في ظل TH 17 مما يؤدي إلى ظروف تحفيزية كما يمكن قياسها بواسطة QPCR.

أثناء حضور هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر تحقيق نقاء خلية سلبية بنسبة 80٪ على الأقل من القرص المضغوط المثبت بأربعة CD 25 قبل احتضان الخلايا تحت ظروف تحفيز TH 17. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تشريح العقدة الليمفاوية والطحال من C 57 ستة فئران سوداء ، وكيفية احتضان الخلايا تحت T ثمانية 17 أو ظروف التحكم في التنشيط ، وكيفية تقييم تمايز الخلايا الليمفاوية التائية الساذجة إلى T ثمانية 17 خلية جنوبا.