العزلة والثقافة، وزرع خلايا العضلات الأقمار الصناعية

الهدف العام من هذا الإجراء هو زرع خلايا الأقمار الصناعية للعضلات الهيكلية للخلايا العصبية البالغة النقية والهادئة لعلاج إصابة عضلات الهيكل العظمي. يتم تحقيق ذلك عن طريق تشريح العضلات الهيكلية أولا من الفئران البالغة وهضم العضلات الهيكلية إنزيميا ، ثم فرز الخلايا الساتلية الهادئة عن طريق فصل الخرزة المغناطيسية. بعد ذلك ، يتم توسيع الخلايا المعزولة على أطباق الثقافة المغلفة بالكولاجين ، وفي الخطوة الأخيرة ، يتم حقن الخلايا الموسعة في المختبر في عضلات الهيكل العظمي المعالجة بالقلب للفئران البالغة.

في النهاية ، يمكن تقييم نقش ومساهمة الخلايا الساتلية الموسعة في المختبر في تجديد ألياف العضلات عن طريق تلطيخ xal. مرحبا ، اسمي سوشي أورا. أنا أستاذ مشارك في معهد الخلايا الجذعية بجامعة مينيسوتا.

يعد عزل الخلايا الساتلية ، وهي مجموعة كبيرة من الخلايا الجذعية ، أمرا ضروريا لفهم بيولوجيا الخلايا الجذعية العضلية والتجديد وكذلك زرع الخلايا الجذعية لعلاجات ضمور العضلات مثل ضمور العضلات الدوشيني الجماعي. الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطريقة الحالية مثل الحقائق هي أن طريقتنا هي طريقة تنقية سريعة واقتصادية وموثوقة لخلايا الأقمار الصناعية الهادئة من عضلة تشتت الفأر البالغة. سيتم تنفيذ الإجراءات التوضيحية من قبل الدكتور ريو موتو ، هاشي باحث ما بعد الدكتوراه ويوكو أسورا عالم مبتدئ في مختبراتي.

لعزل الخلايا أحادية النواة من عضلة الهيكل العظمي للفأر ، ابدأ بقرص ثم قطع جلد البطن لكل فأر بالغ تم قتله الرحيم البالغ من العمر ثلاثة إلى ثمانية أسابيع. قشر الجلد في اتجاهين متعاكسين لكشف العضلة ثلاثية الرؤوس وعضلة الساق الخلفية تماما ، ثم قم بقص عظام الساق لإزالة عضلات الظنبوب الأمامية وعضلات الفخذ الأمامية والعضلة ثلاثية الرؤوس. انقل العضلات إلى PBS بارد ومعقم في صفيحة طولها 10 سم واغسل الدم.

ثم انقل العضلات إلى صفيحة معقمة جديدة بحجم ستة سنتيمترات. بعد ذلك ، تحت المجهر المجسم ، قم بإزالة النسيج الضام والأوعية الدموية والحزم العصبية وإضافة الأنسجة اللبوانية من العضلات. ثم باستخدام مقص العيون ، قم بقص الأنسجة وفرمها إلى لب ناعم.

محاولة عدم ترك قطع كبيرة. انقل العضلات المفرومة إلى أنبوب سعة 50 مليلتر وهضم الأنسجة في خمسة ملليلتر من محلول الكولاجيناز عند 37 درجة مئوية. بعد ساعة ، استخدم حقنة مزودة بإبرة قياس 18 لمعالجة ملاط الأنسجة عدة مرات.

لتجانس الخليط ، احتضان الخليط لمدة 15 دقيقة أخرى ، ثم قم بتجربة الخليط مرة أخرى لفصل الملاط في معلق خلية واحدة ، أضف ما يصل إلى 50 مل من الوسائط واخلط محلول الخلية. ثم قم بتصفية معلق الخلية من خلال مصفاة خلية 70 ميكرون في أنبوب صقر جديد سعة 50 مل. عد الخلايا التي تم جمعها ثم قم بتدوير معلق الخلية بعد غسل الخلايا ، وأعد تعليق الحبيبات في 200 ميكرولتر من الوسائط ، ثم انقل الخلايا إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 ملليلتر لتلطيخ الخلايا وفصلها.

ضع أنبوب الطرد المركزي الدقيق على الجليد ثم احتضن الخلايا بميكرولتر واحد لكل من الأجسام المضادة المدرجة. بعد 30 دقيقة ، اغسل الخلايا في ملليلتر واحد من الوسائط مرتين. ثم أعد تعليق الحبيبات في 200 ميكرولتر من الوسائط واحتضان الخلايا 10 ميكرولتر من الخرز المغناطيسي المضاد ل PE على الجليد.

بعد 30 دقيقة أخرى ، اغسل الخلايا في مليلتر واحد من الحد الأقصى للمخزن المؤقت مرتين وأعد تعليق الحبيبات في مليلتر واحد من العازلة. ثم ضع عمود LD في المغناطيس واشطف العمود ب 1.5 مل من المخزن المؤقت الأقصى. استغن عن تعليق الخلية على العمود ، واجمع التدفق السلبي PE من خلال الكسر في أنبوب سعة 1.5 ملليلتر.

ثم قم بتدوير الجزء السالب PE وأعد تعليق الحبيبات في 100 ميكرولتر من الوسائط. الآن احتضان الخلايا في خمسة ميكرولترات من الخرز المغناطيسي IgG المضاد للولايات المتحدة على الجليد ، ثم بعد 30 دقيقة ، اغسل الخلايا في مليلتر واحد من المخزن المؤقت الأقصى مرتين Resus مع تعليق الحبيبات في 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت. بعد ذلك ، ضع عمود MS على المغناطيس واشطفه بملليلتر واحد من المخزن المؤقت كحد أقصى.

ثم قم بتوزيع الخلايا على العمود ، وتخلص من التدفق السالب ألفا سبعة عبر الكسر. اشطف العمود مرتين باستخدام مليلتر واحد من المخزن المؤقت الأقصى ، ثم قم بإزالته من المغناطيس. ثم اغسل ملليلتر واحد من المخزن المؤقت الأقصى عبر العمود باستخدام مكبس لتصفية سبع خلايا موجبة للإنتجرين المسمى مغناطيسيا في أنبوب طرد مركزي دقيق جديد سعة 1.5 ملليلتر.

ثم بعد تدوير معلق الخلية ، أعد تعليق الخلايا المنقاة في وسط الأرومة العضلية. أخيرا ، ضع الخلايا على صفيحة مطلية بستة سنتيمترات تحتوي على خمسة ملليلتر من وسط البلاستية العضلاتية. للحفاظ على ثقافة الخلايا ، قم بتغذية الخلايا كل يومين بالخلايا العضلية متوسطة النمو.

أظهر شكلا دائريا صغيرا وعبر عن myo D في نواتها. عندما تكون جاهزا لبدء اندماج الخلايا ، اشطف الخلايا مرة واحدة باستخدام PBS ثم قم بتجربتها في حاضنة 5٪ CO2 عند 37 درجة مئوية. بعد ثلاث دقائق ، اجمع الخلايا المنفصلة في وسط الأرومة العضلية ، وقم بتدوير الخلايا ، الحبيبات في وسط الأرومة العضلية ، وأعد الخلايا على ألواح جديدة مطلية بماتريجل.

للتمييز بين ثقافة الخلايا ، قم بتغذية الخلايا كل يومين بوسط تمايز. بعد يوم واحد ، ستخرج الأرومات العضلية من دورة الخلية وتخضع للتمايز إلى سلسلة ثقيلة من الميوسين أو الخلايا العضلية الإيجابية معقد التوافق النسيجي الكبير. بحلول اليوم الثالث إلى الخامس ، تندمج الخلايا مع بعضها البعض وتولد أنابيب عضلية متعددة النوى.

قبل 24 ساعة من زراعة البلاستة العضلية ، احلق الشعر حول عضلة الظنبوب الأمامية أو العضلة TA لفأر انزلاقي مخدر يبلغ من العمر شهرين. ثم استخدم حقنة الأنسولين قياس 31 لحقن 10 ميكرومولار من القلب في العضلات. في اليوم التالي ، افصل الخلايا العضلية المتكاثرة عن الصفائح المطلية بالماتريجيل باستخدام التربسين كما هو موضح للتو وقم بتدوير الخلايا المنفصلة ، وأعد تعليق مرة واحدة من 10 إلى سادس الخلايا في 50 ميكرولترا من الوسائط.

ثم قم بتحميل الخلايا في حقنة أنسولين قياس 31 وزرع الخلايا في الحقن العضلي في المتلقي لتجديد العضلات الأمامية لإصابات الدماغ الرضية. بعد أسبوع إلى أربعة أسابيع من الحقن ، حصاد عضلات TA للتحليل النسيجي. تعرض الخلايا الساتلية الهادئة المعزولة حديثا شكلا دائريا صغيرا ، وأكثر من 90٪ من هذه الخلايا تعبر عن PAC seven كعلامة نهائية.

يمكن استخدام الأرومات العضلية الموسعة خارج الجسم الحي لتجارب حقن الخلايا العضلية لفحص مساهمة الأرومة العضلية في تجديد ألياف العضلات والتجديد الذاتي للخلايا الساتلية. عند استزراعها في وسط التمايز ، تخرج الخلايا العضلية من دورة الخلية وتندمج مع بعضها البعض وتصبح أنابيب عضلية متعددة النوى تعبر عن سلسلة الميوسين الثقيلة بعد بضعة أيام إلى عدة أشهر من الزرع. يمكن اكتشاف الخلايا المشتقة من المتبرع الإيجابي من بيتا جالاكتو ، والتي تشمل الخلايا العضلية المتكاثرة ، والخلايا الساتلية ذاتية التجديد ، وألياف العضلات المشكلة حديثا في العضلات المصابة بالقلب بعد كل تطور.

مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال الخلايا الجذعية العضلية ونشأة العضلات لاستكشاف زرع الخلايا الجذعية لحثل العضلات ، أنا فوشي. أنا يوكو. أنا نوريو ، شكرا.

شكرا لك على المشاهدة.