في فيفو الميكروسكوب ثنائي الفوتون من النهايات العصبية في الجلد واحدة

يتم تقديم بروتوكول للتصوير الطولي دينامية وآفة الليزر الانتقائي من النهايات العصبية في الفئران المعدلة وراثيا مراسل.

الهدف من الإجراء التالي هو دراسة التغيرات الديناميكية الطولية في النهايات العصبية في الجلد بعد الآفة الانتقائية. لهذا ، نقوم بتخدير الفأر المعدل وراثيا YFP ووضعه على وسادة التدفئة للحفاظ على درجة حرارة الجسم. ضع المخلب الخلفي على مادة تغليف بلاستيكية وضع قطرة ماء على الجلد لتحقيق اقتران بصري أفضل.

قم بتغطية العمود الخلفي بزلة غطاء زجاجي متصلة بإحكام بقضيب معدني لتحقيق الثبات. ضع قطرة ماء لهدف الغمر في الماء وقم بإجراء ضعف في التصوير المجهري. إلى جانب الآفة الناجمة عن الليزر في النهايات العصبية ، تؤثر مجموعة متنوعة من الحالات المرضية على ديناميكيات تكامل الجلد.

واحدة من أفضل الطرق للتحقق من هذا التأثير هي تصور التغيرات المرضية في النهايات العصبية الجلدية مباشرة داخل جلد حي. يعد Vivo to photo-microscopy أداة ممتازة لهذا النهج. قبل التصوير ، قم بوزن الفأر وتحفيز التخدير عن طريق حقن الكيتامين بتركيز 80 ميكروغرام من وزن الجسم في زيلازين.

بتركيز 10 ميكروغرام من وزن الجسم. تحقق من التخدير عن طريق الضغط قليلا على الطرف الخلفي للفأر. استخدم قطرات العين اللزجة لمنع جفاف عيون الفأر.

أثناء التصوير من أجل التثبيت ، نستخدم مثبتا معدنيا بتصميم خاص بحلقة. ضع قطرة صغيرة من الغراء على الحلقة وانشرها بشكل موحد. ثم قم بإرفاق زجاج الغطاء بالحلقة المعدنية.

لتسهيل تغطية متساوية لجلد الفأر للتصوير ، نستخدم مجهر فوتونين متاح تجاريا ومجهز بمرحلة آلية. قمنا بتثبيت الحلقة المعدنية مع غطاء زجاجي متجها لأسفل إلى قضيب معدني صلب متصل بإحكام بمرحلة المجهر. نحافظ على درجة حرارة جسم عند 37 درجة مئوية عن طريق إبقائه على وسادة تدفئة.

نظف القطب الخلفي بالإيثانول. أضف قطرة ماء على سطح الجلد للغمر. ضع عمود Hein بين زلة الغطاء الزجاجي ومواد التغليف البلاستيكية.

اضبط المادة لتحقيق أفضل وضع للمخلب الخلفي. أضف قطرة ماء فوق الزجاج لضمان غمر الهدف. قم بقيادة المسرح بمخلب خلفي ثابت تحت الهدف.

أولا ، استخدم مصباح مضان epi للعثور على المنطقة المناسبة للحصول على البيانات. حدد موقع النهاية العصبية محل الاهتمام واكتب إحداثياتها للقياسات المتكررة في نفس المنطقة. بمجرد التركيز على العصب المناسب ، يمكننا التبديل إلى وضع الفوتونين.

اضبط جهدا مناسبا على أنابيب مضاعف الصور. حدد حجم الصورة عادة بين 500 و 800 بكسل ، وقم بتعيين الطول الموجي للإثارة. على سبيل المثال ، عند 915 نانومتر ل YFP.

بعد الحصول على مكدس الصور ، انتقل إلى إجراء الآفة. نستخدم روتين التبييض المتاح في حزمة برامج أوليمبوس ونضبط وقت التعرض بين 100 مللي ثانية وثانية واحدة. اعتمادا على الخصائص البصرية لكل منطقة معينة من الجلد.

ابحث عن مكان تريد فيه عمل الآفة وقم بتشغيل روتين التبييض. بعد الآفة ، تتبع التغييرات باستخدام اللقطات المتتابعة ذات شقين في التصوير على مدار دقائق أو ساعات أو أيام. عادة ما تكون مدة جلسة الصورة حوالي ساعة واحدة ، ولكن يمكن تعديلها بسهولة اعتمادا على المهمة.

بعد القياسات ، نقود المرحلة بالماوس بعيدا عن الهدف. أحضر الماوس إلى صندوق استرداد مضبوطة على درجة حرارة 37 درجة مئوية حتى يستيقظ. يمكن بعد ذلك تكرار إجراء التصوير على مدى أيام وحتى أشهر.

في سياق التحليل دون اتصال بالإنترنت ، يكون من الضروري أحيانا أن تقوم UNIX بالإشارة ذات الاهتمام ، مثل مضان YFP من مضان الترتيب المتداخل. نقوم بإجراء فك الخلط الطيفي باستخدام برنامج Image J. افتح مكدس الصور وقسم القنوات.

ابحث عن المنطقة ذات النهاية العصبية التي يمكن تمييزها بوضوح عن الشعر أو الهياكل الأخرى. تريد أن يونكس من. استخدم المكون الإضافي المسمى الطيف والخلط لحساب معلمات مصفوفة فك الخلط.

أولا ، ابحث عن المنطقة الخالية من الإشارة لقياس مستوى ضوضاء الخلفية. ثم حدد بعناية جزء الشعر الذي يمكن تمييزه عن النهايات العصبية. كلما قمت بالاختيار بدقة أكبر ، كان الفصل أفضل.

ثم حدد بدقة منطقة من النهاية العصبية. أخيرا ، استخدم نفس المكون الإضافي وقم بتطبيق المصفوفة التي تم الحصول عليها لفك خلط البيانات. يجب أن تظهر أعصاب الشعر الآن في قناتين مختلفتين.

نتيجة لذلك ، يمكننا إعادة بناء الهياكل ثلاثية الأبعاد للألياف العصبية وتتبع التغييرات بمرور الوقت. يمكنك استخدام جداول زمنية مختلفة من عدة دقائق إلى عدة أيام وحتى أشهر. أيضا ، يمكن للمرء استخدام خطوط الفأر المعدلة وراثيا الأخرى ، مثل ، على سبيل المثال ، تلك التي تعبر عن علامة الفلورسنت في الميتوكوندريا.

في الجسم الحي ، يعد الفحص المجهري متعدد الصور للهياكل السطحية جنبا إلى جنب مع النموذج المعدل وراثيا المناسب أداة قوية لدراسة العمليات الفسيولوجية والفيزيولوجية المرضية والجلد. يكشف النهج المنهجي الذي أظهرناه في بروتوكول الفيديو هذا عن بعض النصائح الأساسية التي تسمح بإجراء التصوير المجهري متعدد الأضعاف والتلاعب بالجراحة المجهرية على الأعصاب الطرفية في مخطط القوارض بطريقة بسيطة وموثوقة وغير جراحية. نظرا لأنه يمكن تطبيق هذه الطريقة بسهولة على مجموعة متنوعة من نماذج الفلورسنت المعدلة وراثيا المتاحة ، نأمل أن يساعد هذا الفيديو الباحثين الآخرين الذين يجرون تجارب التصوير السطحية.

شكرا لك على المشاهدة ونتمنى لك السعادة في تجاربك.