النهج ChroP يجمع بين الشذرة والطيف الكتلي لتشريح المناظر الطبيعية البروتيومية الحالة رقم محدد من الكروماتين

الهدف العام من هذا الإجراء هو توصيف التركيب البروتيني لمجالات الكروماتين المتميزة وظيفيا من أجل فهم كيفية تآزر العناصر المختلفة لتحديد حالة النسخ. تمانية. يتم تحقيق ذلك عن طريق تحضير النوى أولا من الخلايا المستنبتة وهضم الكروماتين إلى أجزاء ذات طول مثالي من خلال الوسائل الأنزيمية أو الميكانيكية. تتمثل الخطوة الثانية في تنقية مجال وظيفي متميز من الكروماتين السائب عن طريق الترسيب المناعي باستخدام الأجسام المضادة للطعم إما ضد تعديل هيستون بعد الترجمة أو بروتين معروف بتحديد المنطقة محل الاهتمام على وجه التحديد.

بعد ذلك ، يتم فصل بروتينات الكروماتين المنقاة المناعية بواسطة صفحة SDS وهضمها قبل قياس الطيف الكتلي. الخطوة التالية هي تحليل قياس الطيف الكتلي للكروماتوغرافيا السائلة على أداة عالية الدقة. في النهاية ، يتم تحليل البيانات الأولية لقياس الطيف الكتلي بواسطة برنامج مخصص ، متبوعا بالفحص اليدوي للأطياف لتحديد وتحديد تعديلات الهيستون وبروتينات إثراء كوين على التوالي إما على حساب الوفرة النسبية في المواد المترسبة المناعية بالنسبة للمدخلات أو على نسبة SLAC وتجارب المنافسة باستخدام الببتيد القابل للذوبان كمنافس للطعم من خلال المحصول ، يمكننا اكتساب نظرة ثاقبة للتفاعلات بين نمط تعديل Histo والتباين والوصول إلى مناطق الكروماتين المحددة و INTERAC النووي الذي تم تجنيده من خلاله ، والتي تعمل جميعها بطريقة منسقة.

لتحديد مشهد كروماتين معين له تأثير تنظيمي على التعبير الجيني ، فإن الميزة الرئيسية للمحصول على الطريقة الحالية القائمة على الفحص في المختبر للتفاعل القابل للذوبان أو تعديل الأنسجة ، مثل سحب الحمار لأسفل. يعد استخدام قوالب ببتيد الهيستون أو قوالب الكروماتين المعاد تكوينها إمكانية التحقيق في تكوين الكروماتين المحدد للموضع في حالة أكثر أصلية وأقل اصطناعية. يمكن أيضا توسيع تطبيق المحصول ليشمل نظاما نموذجيا آخر أو دراسة تعتمد على الوقت.

على سبيل المثال ، يمكننا استخدام المحاصيل في خط الخلية الذي يستجيب لاضطراب معين يثير استجابة نسخ عالمية. وستكون مونيكا سودي تثبت هذا الإجراء. يتم تحضير باحث ما بعد الدكتوراه في مختبري نوى إجراء رقاقة N من غير مصنف.

خلايا S3 من واحد إلى اثنين في 10 إلى الخلايا الثامنة لكل تجربة. لحصاد الخلايا ، قم بعمل أربع حصص من خمسة في 10 إلى الخلايا السبع في أنابيب 50 مليلتر وأجهزة الطرد المركزي عند 340 مرة G لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية. اغسل الخلايا بالثلج البارد PBS وتخلص من المادة الطافية والريسوس.

تعليق كل بيليه خلية في ثمانية ملليلتر, تحلل, عازلة, ونقل في 15 أنابيب ملليلتر. احتضن لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية على عجلة دوارة. بعد ذلك ، اسكب كل محللة خلوية بعناية على وسادة سكروز وجهاز طرد مركزي في دوار متأرجح عند 3 ، 270 مرة جم لمدة 20 دقيقة عند أربع درجات مئوية لفصل النوى عن السيتوبلازم.

تخلص من المواد الطافية واغسل الكريات النووية مرتين في الثلج. PBS بارد في الغسيل الثاني. قم بتجميع النوى في أنبوب واحد سعة 50 مليلتر بعد التخلص من المادة الطافية من الغسيل الثاني.

أعد تعليق الحبيبات النووية في مليلتر واحد من المخزن المؤقت للهضم. قسم كل عينة إلى حصتين من 500 ميكرولتر واحتفظ بها على الثلج. أضف إلى كل كمية خمسة ميكرولترات من MNA المقابلة للتركيز النهائي 0.005 وحدة من الإنزيم لكل ميكرولتر من النوى.

تخلط بلطف وتحتضن على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة. أضف مللي مولار EDTA لإيقاف التفاعل والحفاظ على الجليد. حبيبات النوى المهضومة عن طريق الطرد المركزي عند 7 ، 800 مرة G عند أربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق.

انقل المواد الطافية إلى أنبوبين وخزنها على أربع درجات مئوية. هذا هو الجزء S الواحد الذي يحتوي على أول جزء قابل للذوبان من الكروماتين يتكون من مناطق أحادية النواة يعلق بعناية الكريات في مليلتر واحد من غسيل الكلى ، والعازلة وغسيل الكلى بين عشية وضحاها عند أربع درجات مئوية في ثلاثة لترات من عازلة غسيل الكلى مع تحريك خفيف مستمر في اليوم التالي. اجمع المواد المحللة وأجهزة الطرد المركزي عند 7 ، 800 مرة جم لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية.

انقل سوبر ناتين إلى أنبوب إينور جديد. هذا هو الكسر S ، الذي يصبغ إلى نيوكليوسومات tta اعتمادا على مدى هضم Ma. يحفظ في درجة حرارة أربع درجات مئوية قبل الترسيب المناعي.

تحقق من جودة ونقص هضم MN a عن طريق الرحلان الكهربائي لجل aros والفحص البصري لسلم النيوكليوسومات كما هو موضح في هذا المثال ، الكسر S واحد غني بدرجة عالية في مناطق أحادية النواة بينما يحتوي الكسر S الثاني بشكل أساسي على النيوكليوسوم لترسيب الكروماتين المناعي. أضف أولا حجما واحدا من المخزن المؤقت لتخفيف الرقاقة إلى الكسر S واحد. ثم أضف الجسم المضاد ضد تعديل ما بعد الترجمة أو البروتين ذي الأهمية واحتضانه طوال الليل على عجلة دوارة عند أربع درجات مئوية في اليوم التالي.

عزل الكروماتين باستخدام الخرز المغناطيسي المقترن بالبروتين G. أضف 100 ميكرولتر من الخرز المسدود إلى عينة الكروماتين S واحتضنها على عجلة دوارة عند أربع درجات مئوية لمدة ثلاث ساعات. بعد ثلاث ساعات.

جهاز طرد مركزي عند 340 مرة G لمدة دقيقة واحدة. ضع أنابيب einor في رف مغناطيسي لحبيبات الخرز. أنقذ المادة الطافية ، وهي التدفق الذي يحتوي على نيوكليوسوم غير مرتبط.

أضف عازلة الغسيل إلى الخرزات واحتضانها لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية على عجلة دوارة قبل الطرد المركزي. بهذه الطريقة ، اغسل الخرزات ما مجموعه أربع مرات مع زيادة تركيز الملح. غسلتان عند 75 مللي مولار كلوريد الصوديوم متبوعا بغسلة واحدة عند 125 ملليمولار وأخرى عند 175 مللي مولار كلوريد الصوديوم للاستئصال.

الكروماتين الأميني المترسب. احتضان الخرزات في 30 ميكرولتر من المخزن المؤقت لعينة LDS مكمل ب 50 مللي مولار. ثلاثة إيتول لمدة خمس دقائق عند 70 درجة مئوية.

يتم فصل البروتينات المشار إليها لاحقا بواسطة صفحة SDS لبدء هذا الإجراء ، وربط الخلايا بالفورمالديهايد. أضف 0.75٪ فورمالديهايد إلى الخلايا المسماة SLAC. تخلط لفترة وجيزة وتحتضن لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.

وجه الفورمالديهايد بإضافة 125 مللي مولار جلايسين وحضانه لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، قسم الخلايا إلى قسمين إلى حصتين إلى أربع حصصات من حوالي خمسة في 10 إلى الخلايا السبع لكل حصة. اشطف الخلايا ثلاث مرات باستخدام PBS المثلج بعد آخر غسلة.

تخلص من المواد الطافية واحتفظ بالكريات تعيد تعليق كل حبيبات خلية في 10 ملليلتر من المخزن المؤقت للتحلل. احتضن لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية مع جهاز طرد مركزي دوراني عند 430 ضعف G لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية. تخلص من المواد الطافية واحتفظ بالكريات النووية.

بعد غسل الكريات النووية باستخدام مخزن الغسيل Resus ، قم بتعليق كل حبيبات نووية في ثلاثة ملليلتر من المخزن المؤقت لحضانة الرقائق واحتفظ بالثلج لتجزئة صوتنة الكروماتين في تمزق حيوي مبرد عند 200 واط. قم بإزالة 2٪ من كروماتين الصوتي وعكس الارتباط المتقاطع عن طريق الحضانة عند 65 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة على الأقل. في مخزن حضانة الرقاقة.

هذه هي مادة الإدخال. بعد ذلك ، يتم استخراج الحمض النووي باستخدام مجموعة تنقية تفاعل البوليميراز المتسلسل ويتم تقييم تجزئة الكروماتين بواسطة الفصادة الكهربائية لهلام أروس لترسيب الكروماتين المتشابك المناعي. أضف الجسم المضاد المفضل إلى الكروماتين الصوتي الخفيف والثقيل.

في القناة الخفيفة ، أضف طية زائدة من الببتيد القابل للذوبان بالإضافة إلى الجسم المضاد لكل من العينات الخفيفة والثقيلة إلى ثلاثة أنابيب طرد مركزي دقيقة لكل منها واحتضانها طوال الليل عند أربع درجات مئوية على عجلة دوارة في اليوم التالي ، أضف 100 ميكرولتر من الخرز المغناطيسي المقترن بالبروتين G إلى كل عينة كروماتين واحتضانها على عجلة دوارة لمدة ثلاث ساعات عند أربع درجات مئوية. جهاز طرد مركزي عند 340 مرة جم لمدة دقيقة واحدة. ضع أنابيب einor في الرف المغناطيسي لحبيبات الخرز.

المادة الطافية هي التدفق من خلال احتوائها على نيوكليوسومات غير مرتبطة ، والتي يتم حفظها للضوابط اللاحقة. اغسل الخرزات أربع مرات في مخزن الغسيل مع زيادة تركيزات الملح. غسلتان عند 150 مللي مولار كلوريد الصوديوم متبوعا بغسلتين عند 300 مللي مولار كلوريد الصوديوم.

احتضان الخرزات لمدة 25 دقيقة عند 95 درجة مئوية و 30 ميكرولترا من صفحة SDS. تحميل المخزن المؤقت للعينة لتصفية البروتينات المترسبة المناعية وربط متقاطع. أخيرا ، قم بتجميع EITs وفصل البروتينات عن طريق صفحة SDS قبل قياس الطيف الكتلي.

يتم هضم الهستونات المخصبة من NIP لبدء هذا الإجراء. يتم قطع شرائح الجل المقابلة لشرائط هيستون الأساسية من الكوماسي الغروية الملطخة بأربعة إلى 12٪ BIS CITRIS أكريلاميد جل التدرج ثم des stain مع 50٪ أسيتيل النتريل في والماء المقطر منزوع الأيونات بالتناوب مع 100٪ أسيتو النتريل لتقليص الجل عندما تكون قطع الجل تماما des. جففها في جهاز طرد مركزي مفرغ.

أضف D ستة أنهيدريد الخليك من واحد إلى تسعة أحجام لكل حجم في بيكربونات الأمونيوم المولية وثلاثة ميكرولترات من أسيتات الصوديوم كمحفز لقطع الهلام. احتضان لمدة ثلاث ساعات عند 37 درجة مئوية مع اهتزاز قوي. قم بتقليص قطع الجل في 100٪ أسيتيل نتريل ثم قم بتجفيفها لمدة خمس دقائق تقريبا في جهاز طرد مركزي مفرغ بعد ذلك ، قم بإعادة ترطيب قطع الجل بالبرودة المثلجة.

100 نانوجرام لكل ميكرولتر محلول تريين في 50 مللي مولار بيكربونات الأمونيوم بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية. إن الجمع بين التعديل الكيميائي لللايسينات باستخدام أنهيدريد الخليك الهضم والتربسين يولد RC كما هو الحال في نمط هضم الهيستون الذي يجمع الببتيدات المهضومة القابلة للذوبان في أنبوب einor جديد ويجفف الببتيدات لمدة ساعة تقريبا. أعد تعليق الببتيدات المجففة بالتجميد في 0.5٪ حمض الخليك 0.1٪ حمض الخليك ثلاثي فلور وتحلية الببتيدات على شطيرة الكربون المعكوسة C 18 وكروماتوغرافيا التبادل الأيوني على أعمدة دقيقة مصنوعة يدويا.

قم بتحميل 50٪ من الببتيدات على طرف مرحلة شطيرة الكربون C 18 و 50٪ على طرف مرحلة SCX Elute الببتيدات من أطراف SCX باستخدام 5٪ هيدروكسيد الأمونيوم و 30٪ الميثانول ومن أطراف الكربون C 18 باستخدام 80٪ أسيتو النتريل ، 0.5٪ حمض الأسيتيك. أخيرا ، تجميد البترول ، والببتيدات المراوغة وإعادة التدوير يعلقها في حمض الفورميك بنسبة 0.1٪ في الترسيب المناعي للكروماتين الأصلي ونهج المحاصيل. يتم هضم الكروماتين باستخدام MNA كخطوة أولى لتنقية مجال وظيفي متميز من الكروماتين السائب.

تظهر اللوحة الموجودة على اليسار اختبار MNA على نطاق صغير يتم فيه حل الحمض النووي على هلام 1٪ aros بعد هضم الكروماتين باستخدام MNA في فترات زمنية مختلفة. يظهر هضم MNA على نطاق واسع على اليمين. يتم حل الحمض النووي على هلام 1٪ aros بعد 60 دقيقة من هضم كروماتين MNAs وبعد فصل S جزء واحد يحتوي على مناطق أحادية النواة ومن S اثنين من الأجزاء التي تحتوي على نيوكليوسومات متعددة.

يتم تحضين الكروماتين المهضوم والمغني بالنيوكليوسومات الأحادية بجسم مضاد يتعرف على تعديل معين بعد الترجمة. على سبيل المثال ، ثلاثي ميثيل ليسين تسعة على هيستون H ثلاثة K تسعة ME ثلاثة ، علامة على الكروماتين الصامت. ثم يتم فصل البروتينات المناعية المنقاة بالإضافة إلى مدخلات الكروماتين بواسطة صفحة SDS ويظهر تلطيخ الكوماسي الغروي هيستونات أساسية H ثلاثة و H four و H اثنين A و H اثنين B حول وتحت نطاق 17 كيلودالتون مع H ثلاثة و H اثنين B يهاجر المقارنة بين كمية الجلايسين الميثيل تسعة على H ثلاثة الموجودة في التدفق من خلال المدخلات تشير إلى أن حوالي 50٪ من المنطقة ذات الأهمية منقية مناعية ، باستثناء خطر التحيز بسبب إثراء مجموعة سكانية فرعية طفيفة من الكروماتين.

يمثل هذا الرسم البياني متوسط زائد ناقص SEM من ثلاث تجارب مستقلة لكل تعديل يتم استخدام MS لتوصيف التعديلات اللاحقة للترجمة المرتبطة بالنيوكليوسومات المخصبة. يتم التحقق من جميع تعديلات ما بعد الترجمة من الهيستون عن طريق الفحص اليدوي لأطياف MS MS المقابلة في هذا الممثل Ms Ms Ms أطياف باستخدام تجزئة CID. تسمح سلسلة أيون B و Y بتعريف تسلسل الببتيد H ثلاثة تسعة إلى 17 ويتم توطين ثلاثي الميثيل على بقايا اللايسين التسعة الخالية من الملصق الكمي عن طريق إنشاء مخطط الأيونات المستخرج أولا أو XIC لكل منها المقابل لكل ببتيد معدل بناء على قيمة شحنة الكتلة وحساب المساحة الموجودة أسفل المنحنى أو UC لكل ذروة.

بعد ذلك ، يتم تقدير الوفرة النسبية لدرجات المثيلة المختلفة على اللايسين تسعة في H ثلاثة تسعة إلى 17 ببتيد بقسمة A UC لكل ببتيد معدل على مجموع المناطق المقابلة لجميع الأشكال غير المعدلة والمعدلة المرصودة من هذا الببتيد. ثالثا ، يتم التعبير عن التخصيب النسبي لكل تعديل في المادة المكسورة كنسبة لوغاريتمية بين الوفرة النسبية لكل مثيلة في الببتيد المكسور على المدخلات. يظهر تحليل الببتيد H ثلاثة تسعة إلى 17 تخصيب اللايسين الميثيل D و TRIMM مع الاستنفاد المقابل للأشكال غير المعدلة وأحادية الميثيل.

مع هذه النتائج كتحكم إيجابي في خصوصية الجسم المضاد ، يمكن تقييم ارتباط cos أو استنفاد جميع التعديلات الأخرى على المستوى داخل الجزيئات على نفس H ثلاثة وعلى المستوى بين الجزيئات على الهستونات الأخرى المخصب في نفس النيوكليوسوم. تلخص هذه الخريطة الحرارية التمثيلية إثراء جميع cos التي تربط H ptms المحددة على histone H three و H four و H two A.كل صف يتوافق مع تعديل مختلف ويشير ND إلى تعديلات غير مكتشفة لفحص جميع البروتينات. يتم استخدام Co المرتبط داخل رقاقة الكروماتين غير المتجانسة من الكروماتين المتقاطع المجزأ عن طريق الصوتنة بالاشتراك مع وضع العلامات على النظائر المستقرة بواسطة الأحماض الأمينية في ثقافة الخلايا أو lac.

أولا ، يتم تقييم كفاءة وضع العلامات عن طريق حساب دمج اللايسين الثقيل والأرجينين الثقيل في البروتينات. للحصول على كمية دقيقة للبروتين ، يلزم دمج أعلى من 95٪ لكل من الأحماض الأمينية الثقيلة كما لوحظ هنا ، فإن متوسط توزيع كثافة ببتيد اللايسين والأرجينين يساوي 0.974 و 0.964 على التوالي. ثانيا ، يجب تحسين نسبة الببتيد القابل للذوبان إلى الجسم المضاد.

يوضح هذا الشكل أطياف كتلة مكبرة عند قيمة شحنة الكتلة المقابلة لاثنين زائد الشحنة التريم ليسين ميثيل تسعة K تسعة ME ثلاثة في H ثلاثة تسعة إلى 17 الببتيد ، لكل من الأشكال الخفيفة والثقيلة في المدخلات وثماني الثماني المتكسرة. أثناء الإدخال ، تكون شدة الببتيد الثقيل والخفيف قريبة من واحد في شريحة SLAC الأمامية. شدة الببتيد الخفيف أقل بكثير من شدة النظير الثقيل ، مما يشير إلى منافسة فعالة.

هنا نتيجة تمثيلية لصفحة SDS لمدخلات الكروماتين الخفيفة L والثقيلة H ورقاقة المواد المترسبة الأمينية المشتركة. تم تقطيع الممر المقابل للمادة المتكسرة إلى 10 شرائح بينما تم تحليل شريحتين فقط من المدخلات. لتحليل اختبار الدمج ، يتم إجراء تجارب منافسة slac عادة في نسختين ، فيما يسمى بالتنسيقات الأمامية والعكسية حيث يتم تحويل المنافسة مع الببتيد القابل للذوبان الزائد من عينات الكروماتين H الثقيلة إلى عينات الكروماتين L الخفيفة.

تظهر هذه الأطياف الكاملة التمثيلية زوج SLAC المقابل للببتيدات من بروتينات HP one و macro two A ، وهي نسبة من البروتين الثقيل إلى الخفيف أكبر من واحد. في التجربة الأمامية التي تعكسها نسبة أقل من واحد في النسخة المتماثلة العكسية ، أظهر التخصيب المحدد لهذه البروتينات في بروتينات الكروماتين غير المتجانسة التي تتشابه شدتها في الأشكال الثقيلة والخفيفة في كل من التجارب الأمامية والعكسية تنتج نسبة ثابتة قريبة من واحد وتصنف على أنها خلفية. يؤدي تقاطع تجارب شرائح X الأمامية والعكسية إلى تحديد 635 بروتينا موجودا في كلتا التجربتين وقياسها كميا بعدد نسبين على الأقل.

يمثل مخطط السجل الثاني لنسبهم الثقيلة إلى الخفيفة ما يسمى بالكروموسوم غير المتجانس. تمثل الخطوط المنقطة الحمراء في هذا المخطط المبعثر أعلى 40٪ و 30٪ من نسب البروتين. كما هو موضح ، يتم تحديد التفاعلات التسعة الميثيلية ليسين الحقيقية بشكل لا لبس فيه على أنها البروتينات الموجودة ضمن أعلى 40٪ من توزيعات نسبة البروتين.

هنا ، يتم عرض توزيعات نسبة البروتين من تجارب محاصيل X الأمامية والعكسية باللون الأسود والأزرق والبرتقالي على التوالي. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحضير الكروماتين ل E والمحصول النهائي لمعالجة البروتينات أحادية الترسيب قبل تحليل قياس الطيف الكتلي. كيفية تحديد وقياس تعديل الهيستون في أطياف الكتلة وكيفية تحديد interac معين على نسب البروتين الخاصة بهم.