الملقط المغناطيسي لقياس تطور وعزم الدوران

الهدف العام من هذه التجربة هو قياس السلالات الالتوائية أو التغيرات في الالتواء جزيئات الحمض النووي المزدوجة التي تقطعت بها السبل على مستوى الجزيء الفردي. يتم تحقيق ذلك باستخدام فحصين في الاختبار الأول يسمى الملقط المغناطيسي الذي يدور بحرية أو الضرب. يتم ربط جزيء DNA واحد وظيفي بين حبة مغناطيسية وسطح زجاجي.

في حين أن المغناطيس الأسطواني الشكل يمارس قوة تمتد الحمض النووي في هذا التكوين ، فإن الموضع الزاوي للحبات مقيد فقط بالحمض النووي المربوط ، وليس المغناطيس ، مما يسمح بدوران الخرزة كما هو موضح في السهم الأحمر للإبلاغ عن التغيرات في الالتواء في التقلبات الحرارية الدورانية للحمض النووي لسبب الخرزة. موضعه XY للاستلقاء على حلقة دائرية أو دونات. يتيح تحويل موضع XY هذا إلى زاوية دوران مراقبة التغييرات في تطور الحمض النووي المربوط في اختبار ثان ذي صلة يسمى ملاقط عزم الدوران المغناطيسي ، أو يضاف المغناطيس الجانبي MTTA إلى المغناطيس الأسطواني الرئيسي لتقييد الحركة الزاوية للحبات.

مع هذا التكوين المغناطيس ، يمكن تطبيق عزم الدوران الخارجي على جزيء الحمض النووي المربوط من خلال الدوران البسيط لمجموعة المغناطيس ، وقياسات انحراف الموضع الزاوي للحبات بعد تطبيق عدد من المنعطفات مقارنة بتكوينه الأولي المريح الالتوائي ، جنبا إلى جنب مع معايرة صلابة المصيدة المغناطيسية التي تحد من الخرز ، تجعل الحركة الزاوية من الممكن تحديد تراكم عزم الدوران في الحمض النووي. الميزة الرئيسية لاستخدام الخط و MTT على الملقط المغناطيسي التقليدي هي أنه يمكننا قياس عزم الدوران والتغيرات في تطور الأحماض النووية مباشرة. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية حول ميكانيكا الحمض النووي والحمض النووي الريبي من خلال السماح لنا برسم استجاباتهم للقوى الخارجية وعزم الدوران.

تمتد الآثار المترتبة على هذه التقنية إلى استكشاف تفاعلات الحمض النووي مع البروتينات. على سبيل المثال ، البروتينات المسؤولة عن تخزين إصلاح الحمض النووي ، أو النسخ يوضح العرض المرئي لهذه الطريقة مدى سهولة تعديل إعداد الملقط المغناطيسي التقليدي لمنحه قدرات جديدة. يعتمد الإعداد المستخدم في التجارب التالية على إعداد ملاقط مغناطيسية تقليدية.

يوجد في وسطها خلية تدفق مضاءة من الأعلى بواسطة مصباح LED ويتم تصويرها من خلال هدف مجهر وكاميرا CCD من الأسفل. يوجد فوق خلية التدفق رأس مغناطيسي يمكن تحريكه لأعلى ولأسفل وتدويره باستخدام محركات يتم التحكم فيها بواسطة الكمبيوتر. يتم تحليل الصور من كاميرا CCD في الوقت الفعلي بواسطة برنامج عرض مختبري مخصص لتحديد موضع X و Y و Z للحبات المربوطة بالحمض النووي.

يتوفر برنامج عرض المختبر المخصص من المؤلفين عند الطلب. بعد تحضير خلية تدفق بخرز مغناطيسي مرتبط بالحمض النووي ، قم بتثبيتها على الملقط المغناطيسي التقليدي واختيار كل من السطح الثابت للحبة المرجعية وحرزة يتم ربط جزيء الحمض النووي الفردي بالطول المناسب. يمكن تحويل الإعداد إلى وضع الخط.

ابدأ بفك رأس المغناطيس الكامل يدويا الذي يحمل المغناطيس لتكوين الملقط التقليدي. استبدله برأس المغناطيس الذي يحمل مغناطيسا أسطواني للخط. أثناء وضع المغناطيس الأسطواني المستخدم ل F في رأس المغناطيس ، تأكد من الاحتفاظ بحبل الحمض النووي المحدد في مجال الرؤية.

أصعب جانب في هذا الإجراء هو محاذاة المغناطيس بشكل صحيح لهندسة النموذج. يتم تحقيق محاذاة جيدة من خلال تحريك المغناطيس بشكل منهجي واختبار المحاذاة بعد كل خطوة ، والتي سنوضحها. الآن ، قم بإجراء محاذاة الدورة التدريبية للمغناطيس في الخط باستخدام مراحل الموضع لتحريك المغناطيس يدويا في برنامج عرض المختبر.

انقر فوق زر التسجيل لقياس تقلبات أو رحلات موضع XY. يتم عرض الآثار المسجلة على الشاشة في الوقت الفعلي وحفظها كملفات نصية تحتوي على معلومات موضع X و Y و Z. إذا اتبعت رحلات XY قوسا كما هو موضح هنا ، فإن المغناطيس الأسطواني غير محاذي بشكل صحيح ، واستمر في تحريك المغناطيس الأسطواني في الاتجاه المناسب وأخذ القياسات حتى تتبع تقلبات XY نمطا دائريا كاملا ، مما يشير إلى أن محاذاة المسار قد تحققت. مقبل.

إذا لزم الأمر لمزيد من التجارب، فقم بإجراء محاذاة دقيقة في الخط باستخدام مرحلة مؤتمتة عالية الدقة لتحريك خلية التدفق، ومحاذاة المغناطيس الأسطواني في حدود حوالي 10 ميكرون من الخرزة. ثم كما كان من قبل ، سجل رحلات XY. استمر في تحريك المسرح وتسجيل الرحلات حتى تصبح التقلبات على الحلقة الدائرية موحدة تقريبا.

للتحقق من المحاذاة النهائية ، استخدم نص MATLAB المتاح من المؤلفين عند الطلب لرسم التقلبات في الرسم البياني أو الرسم البياني وفحصه للتأكد من التوحيد. لأخذ قياسات عزم دوران الحمض النووي ، قم بإزالة المغناطيس الأسطواني المستخدم للخط واستبدله بمغناطيس أسطواني بالإضافة إلى مغناطيس جانبي دائم. بالنسبة إلى MTT ، تأكد من بقاء حبل الحمض النووي المحدد داخل مجال الرؤية.

أدخل عدد ومعدل المنعطفات المغناطيسية في اللوحة المقابلة لبرنامج عرض مختبر التحكم. هنا. يتم ضبط عدد المنعطفات على خمسة ويتم ضبط المعدل على 0.1 هرتز. سيؤدي ذلك إلى دوران المغناطيس ببطء أثناء القياس.

بعد ذلك في matlab ، استخدم نصا برمجيا للتتبع الزاوي بناء على مراقبة موضع XY ، وهو متاح من المؤلف عند الطلب. ستظهر مخططة تعرض التقلبات الزاوية كدالة للوقت ، ستظهر ثيتا T. بمجرد إعداد كل شيء في عرض المختبر ، انقر فوق زر التسجيل.

ستظهر الآثار في الوقت الفعلي كما كان من قبل. في matlab ، استخدم نص MATLAB لإنتاج مخططات لزاوية ثيتا T وارتفاع الخرزة Z من T على الشاشة مع ملاءمة Gaussian لإشارة الزاوية لتحديد الانحراف المعياري للتقلبات الزاوية. سيجما ثيتا.

يحدد هذا البرنامج النصي بشكل مباشر صلابة المصيدة الالتوائية من تباين التقلبات الزاوية. سيجما ثيتا مربعة بالراديان. باستخدام الصيغة الموضحة هنا ، لاحظ أنه من المعتاد في MTT تحقيق صلابة المصيدة الدورانية من 10 إلى 1000 بيكو نيوتن نانومتر لكل راديان ، وهو أقل بكثير مما هو عليه في الملقط المغناطيسي التقليدي.

هنا، على سبيل المثال، حددنا أن صلابة المصيدة الدورانية تساوي حوالي 52 نانومتر خنزير لكل راديان. إن صلابة المصيدة الدورانية لملاقط عزم الدوران المغناطيسي مقارنة بالملاقط المغناطيسية التقليدية تجعلها مناسبة لقياسات عزم دوران الجزيء الفردي ، ولكنها تعني أيضا أن الحد الأقصى لعزم الدوران الذي يمكن ممارسته ينخفض. هذا يعني أن MTT لا يمكنها موازنة عزم السحب الناجم عن الدوران السريع.

لذلك يجب الحرص على عدم الدوران بسرعة كبيرة. عادة ما ندور بمعدلات حوالي 0.1 هرتز. بعد ذلك ، يتم طغت حبل الحمض النووي عن طريق تدوير المغناطيس ببطء ، وعدد محدد من المنعطفات ، ومن خلال تسجيل أثر آخر للتقلبات الزاوية ، يتم إدخال عدد ومعدل دورات المغناطيس مرة أخرى في اللوحة المقابلة لبرنامج عرض مختبر التحكم.

هنا يتم ضبط عدد المنعطفات على 40 ويتم ضبط المعدل على 0.1 هرتز. سيؤدي ذلك إلى دوران المغناطيس ببطء أثناء القياس لتحديد عزم الدوران المتراكم في حبل الحمض النووي. بعد أن يدور N ، نستخدم الصيغة الموضحة هنا حيث تشير الأقواس المائلة إلى المتوسط وثيتا صفر.

و theta N هي الزاوية عند الصفر المنعطفات المقابلة لحبل الالتواء والدوران على التوالي. كرر الخطوات التي يتم فيها تدوير المغناطيس وسجل هضبة من التقلبات الزاوية حسب الضرورة من أجل تحديد استجابة التوك للجزيء بشكل كامل في عملية قياس واحدة. لقياس التغيرات في تطور الحمض النووي الناجم عن بروتين الإصلاح RAD 51 الذي يرتبط بالحمض النووي المزدوج الذي تقطعت به السبل ، يطول ويسترخي.

تمت إضافة DNA rad 51 إلى جزيء الحمض النووي المرتبط بالخط. كما هو موضح هنا ، فإن الخرزة تتبع مسارا متصاعدا. يمكن فصل هذه الحركة إلى مكونات تصف كيفية إطالة الحمض النووي وتفكيكه بمرور الوقت.

لقياس عزم الدوران المخزن في الحمض النووي باستخدام MTT ، تم قياس الجزيء مع الجرح وتحت الجرح بشكل منهجي والتقلبات الزاوية لكل عدد من المنعطفات المطبقة. يجب أن يكون الانحراف المعياري للتقلبات الزاوية ، والذي يبلغ عن صلابة المصيدة الزاوية مستقلا عن عدد المنعطفات المطبقة. هنا ، يبلغ الانحراف المعياري حوالي تسع درجات كما هو موضح هنا.

يتغير متوسط المواضع الزاوية بشكل منهجي مع عدد المنعطفات المطبقة باستخدام صلابة المصيدة الزاوية الثابتة. يتم تحويل التغييرات في متوسط الزاوية إلى عزم دوران ، مما ينتج عنه عزم الدوران المخزن في الحمض النووي مقابل المنعطفات المطبقة. ينتج عن التسجيل المتزامن لموضع الخرز Z طول الحمض النووي مقابل المنعطفات المطبقة.

عن هذان المنحنيين معا الاستجابة الميكانيكية الكاملة للحمض النووي للملف الزائد والسفلي. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية قياس الجزيئات البيولوجية ولفها وعزم الدوران عليها باستخدام الملقط المغناطيسي الذي يدور بحرية وملاقط عزم الدوران المغناطيسي لمقايسات الجزيء الفردي الجديدة التي يمكن تكييف الملقط المغناطيسي التقليدي معها بسهولة. يمهد تطوير هذه التقنيات الطريق للبحث في مجال الفيزياء الحيوية ، على سبيل المثال ، لدراسة الخصائص الالتوائية للحمض النووي أو الحمض النووي الريبي ومراقبة عمليات مثل ضغط الحمض النووي وإصلاحه يمكن تحسين تقنيات الخط و MTT بطرق أخرى مثل الكشف عن التألق من أجل الإجابة على أسئلة إضافية مثل تحديد الموقع المعين للبروتين على الحمض النووي المربوط.