4.14: ثقافة الفرخ ex ovo

الفرخ هو كائن حي نموذجي متعدد الاستخدامات لدراسة مسارات النمو لأن معظم تطوره يحدث خارج الأم. ومع ذلك ، فإن قشر البيض يمنع الوصول إلى الجنين لبعض أشكال التجارب. لحسن الحظ ، يمكن احتضان الكتاكيت خارج القشرة ، أو ?ex ovo ،? استخدام بعض مستلزمات المختبر المتوفرة بشكل شائع. في هذا الفيديو ، ستتعرف على مبادئ الثقافة خارج البيض ، والإجراءات خطوة بخطوة لطريقتين مختلفتين للثقافة ، وتطبيقات التقنية في الدراسات التنموية.

قبل الحديث عن كيفية تربية الكتاكيت ex ovo ، دعنا ننتقل إلى بعض مبادئ التقنية. داخل البيضة ، يتطور الفرخ في ارتباط وثيق مع غشاء الزجاجي المحيط بالصفار. يتم ملء الحجم المتبقي بالألبومين ، أو بياض البيض ، الذي يحمي الجنين ويعمل كمصدر للبروتين.

يمكن إجراء الاستزراع خارج القشرة عن طريق مزرعة صفار البيض الكاملة ، باستخدام جميع محتويات البيض في وعاء بسيط. بدلا من ذلك ، يمكن استئصال الأنسجة الجنينية وزراعتها في ثقافة خارج البيض. كلتا الطريقتين لهما مزايا مميزة على استخدام البيض ذي النوافذ.

أولا ، يعد تشغيل أجنة الدجاج في المرحلة اللاحقة أمرا معقدا بسبب وجود العديد من الأوعية الدموية الهامة ، والتي تتطور داخل الأغشية التي تحيط بالفرخ. هذا يجعل طريقة ex ovo مفضلة للعمل مع الكتاكيت في مراحل لاحقة.

ثانيا ، نظرا لأنها يمكن أن تتناسب مع منصات التصوير ، فإن إعدادات ثقافة ex ovo أكثر قابلية للتصوير عالي الدقة.

علاوة على ذلك ، فإن إزالة الأجنة من القشرة تكشف عن عدد أكبر من الأنسجة للتلاعب التجريبي مثل الجراحة المجهرية والحقن المجهري.

نظرا لأن الفرخ يعتمد على قشر البيض للحماية والمعادن الأساسية ، فإن بقاء الجنين بدون هذا الهيكل يتطلب بعض العناية الإضافية. على سبيل المثال ، يجب تصميم السكن للحفاظ على بيئة معقمة ورطبة ، ويجب توفير العناصر الغذائية في شكل ألبومين أو وسط ثقافة. للثقافة طويلة الأمد ، القشرة المكسرة مطلوبة أيضا كمصدر للكالسيوم. علاوة على ذلك ، نظرا لأن التوتر على الأغشية الداعمة للجنين مهم للتطور الطبيعي ، فإن ثقافة ex ovo الناجحة تعتمد أيضا على السكن الذي يحافظ على مورفولوجيا الغشاء الطبيعية.

الآن بعد أن تعرفت على الأساسيات ، حان الوقت للخروج! لتحضير البيض لثقافة صفار البيض الكامل ، ابدأ باحتضانه عند 37.5؟ ج حتى قبل المرحلة المطلوبة مباشرة.

أثناء انتظارك ، قم بإعداد السكن. تستخدم أطباق بتري وقوارب الوزن والأراجيح بشكل شائع لحمل محتويات البيض. أولا ، قم بتعقيم جميع المكونات عن طريق المعالجة بالأشعة فوق البنفسجية أو الإيثانول.

بالإضافة إلى ذلك ، قم بإعداد غرفة خارجية مملوءة بالماء المعقم للحفاظ على الرطوبة أثناء الحضانة.

عندما يصبح البيض جاهزا ، ضعه في وضع أفقي لبضع دقائق حتى يرتفع الجنين إلى الأعلى. ثم اكسر الجزء السفلي من القشرة وانقل محتويات البيض بعناية إلى السكن. أخيرا ، قم بتغطية الوعاء السكني للحفاظ على الرطوبة ، وضع الإعداد في حاضنة حتى يتم الوصول إلى العمر المطلوب للمعالجة النهائية.

تتطلب استراتيجية ex ovo البديلة ، ثقافة الزرع ، بضع خطوات إضافية بعد إزالة الجنين من القشرة.

في هذه التقنية ، يتم فصل غشاء vitelline برفق عن صفار البيض ، ويحمل معه الجنين النامي.

بعد ذلك ، يتم تثبيت الغشاء من أجل الحفاظ على التوتر ، والذي يمكن القيام به عن طريق سحب الأنسجة بإحكام حول حلقة زجاجية أو عن طريق الالتصاق البسيط بورق الترشيح.

بعد التركيب ، يضاف وسط الثقافة لتغطية الأنسجة ، ويوضع الجنين في غرفة رطبة.

يمكن الآن إعادة الأجنة المستزرعة إلى حاضنة لمدة تصل إلى 24 ساعة من التطوير.

بعد تعلم مبادئ وأساليب ثقافة ex ovo ، نحن مستعدون لبعض لعب الطيور.

تعد ثقافة البيض خارج البيض مفيدة بشكل خاص عندما تحتاج إلى تغيير التعبير الجيني في الأجنة الأكبر سنا. أحد طرق ذلك هو التثقيب الكهربائي ، حيث يتم استخدام تيار كهربائي لاختراق أغشية الخلايا لتوصيل المادة الوراثية. نظرا لأن الأجنة المستزرعة خارج البيض يمكن الوصول إليها أيضا بشكل كبير للتصوير ، يمكن بسهولة التحقق من امتصاص المادة الوراثية من خلال التصوير الفلوري للأجنة الكاملة.

من الممكن أيضا التصوير في الوقت الفعلي لديناميكيات الخلية باستخدام ثقافة ex ovo. يمكن أن تشكل الخلايا السرطانية البشرية أورام عن طريق اختيار الأوعية الدموية للغشاء المشيمي أو CAM. بعد تكوين الورم ، يمكن حقن جزيئات الفلورسنت مباشرة في مجرى الدم وتتبعها في الوقت الفعلي. يمكن استخدام تراكم الجسيمات في أنسجة الورم كمؤشر على تكوين الأوعية الدموية ، أو تكوين أوعية دموية جديدة.

على الرغم من أنه يمكن استزراع الأجنة الكاملة باستخدام تقنيات الاستخراج ، إلا أن بعض التجارب تتطلب تشريح الأنسجة الجنينية قبل الاستزراع. على سبيل المثال ، يمكن استئصال الأنسجة العصبية النامية ونموها على زلات الغطاء الزجاجي. بعد فترة من الحضانة ، يمكن ملاحظة مجموعة معينة من الخلايا تعرف باسم القمة العصبية وهي تهاجر بعيدا عن الأنسجة. يمكن بعد ذلك استخدام العلاج بالعوامل التجريبية والتصوير بفاصل زمني لاختبار العوامل التي تتحكم في هجرة الخلايا.

لقد شاهدت للتو دليل JoVE لثقافة الفرخ السابق البيضاف. غطى هذا الفيديو مبادئ ثقافة ex ovo ، وأساسيات طرق صفار البيض الكامل والاستخلاص ، وبعض الطرق التي تستخدم بها هذه التقنيات في المختبرات اليوم. شكرا للمشاهدة!