Electrospun الليفية سقالات بولي (الجلسرين-dodecanedioate) للهندسة الأنسجة العصبية من الخلايا الجذعية الجنينية الماوس

هذا الإجراء ، يصنع ألياف طويلة مغزولة من بوليمر جديد قابل للتحلل يسمى بولي جلسرين دوت كانو ثمانية. قم أولا بإعداد المجمع المصمم حديثا وإعداد المحلول البوليمري للغزل الكهربائي ، باستخدام حقنة ومضخة ، وتسليم المحلول إلى المجمع. ثم انقل حصيرة الألياف الناتجة إلى طبق ثقافة للربط المتقاطع.

بعد ذلك ، البذور الخلايا الجذعية الجنينية للفأر على الألياف المقطوعة. في النهاية ، يمكن أن تظهر النتائج أن الخلايا الجذعية الجنينية للفأر يمكنها البقاء على قيد الحياة والتمايز إلى خلايا عصبية على السقالات الليفية. في فيديو اليوم ، أوضحنا لك كيفية تحضير المادة الحيوية من تصنيع الخلايا المتزامنة ، وأخيرا استخدام تلك الألياف الكهربائية لزراعة الخلايا.

خاصة عندما نتحد مع الخلية المشتقة من خلية بولي وصبغة. قد يكون لها تطبيق مهم جدا في المستقبل لتوصيل الخلايا وكلها تصنع نسيجا وظيفيا. الأنسجة invis اليوم أنها ستظهر إجراء فظيعا بالنسبة لك.

إنها أعظم شيء في مختبري. قطع رقائق الألومنيوم إلى قطعة مستطيلة. قم بطي القطعة المستطيلة في شريط مستطيل وإرفاقها بشكل عمودي على صفيحة معدنية مسطحة بشريط لاصق.

يعتمد طول الشريط على حجم حصيرة الألياف اللازمة للمحلول البوليمري. خلط الجلسرين والقيام بحمض ديكان ثنائي السمك بنسبة واحد إلى واحد مولار عند 120 درجة مئوية لمدة 100 ساعة. للحصول على بولي جلسرين ، قم بإذابة البوليمر الديكانويك أكسيد البولي إيثيلين والجيلاتين في 65٪ إيثانول بنسبة وزن من 1.5 إلى ثلاثة إلى 95.5 في أنبوب سعة 15 ملليلترا.

شد الغطاء وسخني الخليط في فرن على حرارة 60 درجة مئوية لمدة ساعة مع التحريك كل 15 دقيقة حتى يصبح المحلول القاعدي متجانسا. للغزل الكهربائي ، امزج بوليمر PGD والمحلول القاعدي. بنسبة وزن من أربعة إلى ستة ، أضف 0.1٪ ريبوفلافين إلى الخليط واخلطه جيدا.

قم بتغذية المحلول البوليمري في حقنة قياسية سعة خمسة ملليلتر بإبرة من الفولاذ المقاوم للصدأ بقياس 18. ثم أدخل المحقنة في مضخة حقنة. قم بتوصيل الرصاص المؤرض لمصدر طاقة عالي الجهد باللوحة المعدنية والرصاص المشحون إيجابيا بالإبرة.

أيضا ، اضبط المسافة بين الإبرة ورقائق الألومنيوم. شريط إلى 15 سم. الآن ضع مضخة الحقنة بزاوية حوالي 15 درجة مع الوضع الأفقي لمنع تراكم الألياف في مقدمة الشريط.

قم بتشغيل مضخة الحقنة واضبط معدل تدفق المضخة على 0.6 مل في الساعة. قم بتشغيل مصدر الطاقة عالي الجهد واضبط جهد التشغيل على 14.6 كيلو فولت. بعد اكتمال التجميع ، قم بتعريض حصيرة الألياف لضوء الأشعة فوق البنفسجية لمدة 60 دقيقة من الربط المتقاطع.

انقل حصيرة الألياف من شريط رقائق الألومنيوم إلى طبق بتري 100 ملم. قطع حصيرة الألياف إلى قطع مستديرة من نفس الحجم باستخدام الشفرة الجراحية وضع القطع في لوحة 24 بئر. ثم قم بتعريض اللوحة للأشعة فوق البنفسجية لمدة 20 دقيقة أخرى للتعقيم للخلية السابقة للعلاج.

اغمر عينات الألياف في مليلتر واحد من محلول ملحي مخزن بالفوسفات واحتضان 37 درجة مئوية طوال الليل في اليوم التالي. استنشق PBS بعناية. أضف ملليلترا واحدا من وسط التمايز إلى كل بئر واحتضنه عند 37 درجة مئوية لمدة ثلاث ساعات.

بعد شفط وسط التمايز ، أضف بعناية 0.2 مل من هلام ماتري إلى كل عينة من الألياف واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. قم بإزالة جل ماتري الزائد بعناية من كل منها. شطف جيدا مرة واحدة مع ملليلتر من وسط التمايز.

أضف ملليلترا واحدا من تاس إلى طبق زراعة الخلايا الجذعية الجنينية للفأر بعد 10 دقائق ، 37 درجة مئوية. عندما يتم فصل خلايا MES ، أضف أربعة ملليلتر من وسط التمايز. اجمع خلايا MES العائمة في جهاز طرد مركزي أنبوبي سعة 15 مليلتر عند 400 جي في الثانية لمدة خمس دقائق.

أعد تعليق الخلايا المحببة في أربعة ملليلتر من التمايز. متوسط. انقل 200 ميكرولتر من تعليق الخلية إلى أنبوب سعة 15 مليلتر وأضف 10 أحجام من التمايز. متوسط. انقل 15 ميكرولترا من معلق الخلية المخفف إلى غرفة على مقياس الخلوي الدموي.

مع وجود زلة غطاء في مكانها ، احسب الخلايا في مربع الوسط المليمتر الواحد ومربعات الزوايا الأربعة لمقياس الخلوي الدموي. الآن تسقط خمس في 10 إلى الرابع. خلايا الفأر الجذعية الجنينية ببطء في منتصف عينات الألياف.

أضف ملليلترا واحدا من وسط التمايز لكل بئر وزراعته عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لربط الخلية. النمو والتمايز. قم بتجديد المليلتر الواحد من وسط التمايز كل يومين.

لقياس صلاحية الخلية ، قم بشفط الوسط القديم من كل بئر وأضف ملليلترا واحدا من واحد من كل 10 كاشف مخفف ومضان في الثقافة. يحتضن متوسط عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة أربع ساعات محمي من الضوء المباشر. ثم نقل عينات ثلاثية من 100 ميكرولتر من كل بئر إلى لوحة 96 بئر وقياس صور المجهر الإلكتروني الماسح الفلوري لتقييم مورفولوجيا الألياف المغزولة بالكهرباء.

أقطار هذه الألياف المصنوعة من تركيز 40٪ PGD في نطاق الميكرومتر هنا. تمت زراعة الخلايا الجذعية الجنينية المتمايزة للفأر لمدة ثلاثة أيام على الألياف وتم استخدام الفحص المجهري متحد البؤر لتصور البروتين الفلوري الأخضر المعبر عنه. يشير العدد المتزايد من الخلايا الفلورية الخضراء في اليوم السادس إلى أن السقالات الليفية يمكن أن تدعم كلا من التصاق الخلايا وتكاثر الخلايا.

أظهرت قياسات Zu والفلورة أن الطلاء بالماتريجيل واللامينين أدى إلى بقاء الخلية المكافئة وانتشار أعلى نسبيا. تم قياس فاعلية الفوري وعلامات الخلايا العصبية بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي في اليوم الأول. عبرت غالبية خلايا MES المزروعة على الألياف عن علامات تعدد القدرات.

أكتوبر أربعة نانو و SOX اثنان. عبرت مجموعة فرعية ثانوية عن علامات الخلايا الجذعية العصبية PAC six و neston. بعد أسبوعين في الثقافة ، كانت هناك مستويات زيادة في التعبير عن بعض علامات الخلايا العصبية ، مثل الخريطة الثانية و DCX بالإضافة إلى علامة قليلة التغصن oligo one وعلامة الخلايا النجمية.

GFAP بمجرد إتقانها. يمكن إجراء هذه التقنية في غضون ساعتين إلى ثلاث ساعات إذا تم إجراؤها بشكل صحيح.