الجيل المقبل من تسلسل خاص بالريبوسوم 16S RNA جين Amplicons

الهدف العام من هذا الإجراء هو تسلسل 16 S-R-R-N-A. يتم تضخيم الجينات من العينات البيئية باستخدام آلة التسلسل على الطاولة. يتم تحقيق ذلك عن طريق تضخيم الجين 16 S-R-R-N-A أولا باستخدام بادئات معدلة.

الخطوة الثانية هي تنقية منتجات التضخيم وتحديدها كميتها وتجميعها. بعد ذلك ، يتم إرفاق تجمع Amplicon بمجالات التسلسل التي يتم تضخيمها بشكل نسيلي أثناء مستحلب PCR وتسلسلها على جهاز التسلسل على الطاولة. الخطوة الأخيرة هي تحليل مجموعات بيانات التسلسل الناتجة.

في نهاية المطاف 16 S-R-R-N-A. يستخدم تسلسل أمبليكون الجينات لتحديد تكوين وتنوع المجتمع الميكروبي في عينة بيئية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية مثل DGG أو تسلسل الاستنساخ ، هي أنها تعطي منظورا أعمق وأكثر وضوحا لتكوين المجتمع الميكروبي وتنوعه.

يمكن أن تساعدك هذه الطريقة في الإجابة على أحد الأسئلة الرئيسية في علم البيئة الميكروبية ، من هناك لبدء البادئات الأمامية والعكسية؟ يتناسب المزيج الرئيسي مع اثنين من X hot start tac بالإضافة إلى المزيج الرئيسي والعينات ، وتسلسل الاشعال الأمامية والخلفية مع القالب المعروض. يحتوي التسلسل على محولات أيونية محددة.

مفتاح تسلسل لمعايرة شدة الإشارة في بداية التسلسل. قم بتشغيل قالب تمهيدي خاص ورمز شريطي مكون من 10 زوج أساسي. ثم اخلطي الاشعال والعينات جيدا قبل الاستخدام.

تحضير تفاعل تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). امزج 20 ميكرولترا لكل تفاعل يحتوي على 0.5 ميكرومولار من التمهيدي العكسي ، و 0.4 ملليغرام لكل مليلتر من BSA وواحد X بداية ساخنة بالإضافة إلى مزيج رئيسي. بعد ذلك، تضيف الماصة 18.5 ميكرولتر من المزيج الرئيسي في كل أنبوب تفاعل البوليميراز المتسلسل 0.5 ميكرولتر من محلول مخزون أولي أمامي سعة 20 ملليمولار يحتوي على رمز شريطي مختلف لكل عينة من العينات التي سيتم تسلسلها معا.

ثم خارج غطاء تفاعل البوليميراز المتسلسل ، أضف ميكرولتر واحد من العينة بتركيز واحد إلى 10 نانوجرام لكل ميكرولتر إلى أنبوب تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). ضع برنامجا بتمسخ أولي يبلغ 95 درجة مئوية لمدة خمس دقائق. ثم 25 دورة من 95 درجة مئوية لمدة 30 ثانية.

55 درجة مئوية لمدة 30 ثانية و 72 درجة مئوية لمدة 45 ثانية. يجب أن يكون الاستطالة النهائية عند 72 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. ضع الأنابيب في جهاز PCR وابدأ البرنامج.

يمكن وضع منتجات PCR النهائية عند أربع درجات مئوية أو سالب 20 درجة مئوية حتى يتم استخدامها. قم بإعداد جل 2٪ aros باستخدام أكبر أمشاط متاحة. ثم امزج خمسة ميكرولترات من صبغة تحميل هلام ستة × مع كل تفاعل تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل وقم بتحميل العينات على الجل الذي يفصل كل عينة بفارغة.

قم بتشغيل الجل جيدا عند 70 فولت لمدة 50 دقيقة. بعد تشغيل الجل ، التقط صورة للهلام وقم بقص الأربطة باستخدام مشرط. من المتوقع أن يتكون كل نطاق من حوالي 250 زوجا أساسيا ، والذي يحتوي على 190 زوجا أساسيا مع 63 زوجا أساسيا يتكون منها المحولات والرموز الشريطية.

بعد ذلك ، قم بوزن الأشرطة المقطوعة واستمر في استخراج الجل وتنقية منتجات PCR. باستخدام مجموعة مثل مجموعة أدوات استخراج الجل السريع بقوارب الكاياك ، ثم قم بتحديد كل منتج من منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام بيكو جرين وقم بعمل تخفيفات للحصول على محلول مخزون بخمسة أضعاف 10 إلى الجزيئات التاسع لكل ميكرولتر ، وهو ما يقرب من نانوجرام واحد لكل ميكرولتر. إذا أظهرت بعض العينات تضخيما أقل ، فاضبط التركيز حسب الضرورة ، ولكن لا تقل عن 1.57 في 10 إلى الجزيئات السابعة لكل ميكرولتر.

قم بتجميع 10 ميكرولتر من كل منتج PCR مخفف للحصول على مجموعة مولية متساوية من العينات ، وقم بإعداد تجمع واحد منفصل لكل عملية من عمليات التسلسل المخطط لها. يمكن حفظ منتجات PCR المجمعة في الفريزر حتى تستخدم لأداء المستحلب. تفاعل البوليميراز المتسلسل أولا ، قم بتخفيف منتجات PCR المجمعة إلى 26 بيكامولار بحجم 25 ميكرولتر وقم بتحريك الكواشف من مجموعة قوالب PGM الأيونية.

ثم اعمل في غطاء PCR وقم بإعداد مستحلب PCR. امزج منتجات PCR المجمعة ويمكن إضافة جزيئات الكرة عند العمل على المقعد. امزج المحلول جيدا ثم أدخل الخليط في خرطوشة الفلتر وقم بتغطيته بزيت المستحلب بعناية.

بعد ذلك ، قم بعكس خرطوشة الفلتر ببطء وقم بتحميل الخرطوشة على جهاز PCR المستحلب الآلي. ثم حدد البرنامج المناسب وابدأ الإجراء. بعد اكتمال المستحلب الآلي PCR ، قم بإزالة المادة الطافية من أنابيب التجميع واسترجع جزيئات الكرة في الجزء السفلي من الأنابيب. ريسوس.

قم بتعليق الكرات في 100 ميكرولتر من محلول الغسيل وخذ كمية ميكرولتر لقياس كمية المكتبة. لتسلسل منتجات PCR، قم بإعداد خطة تشغيل التسلسل التي تحدد تفاصيل تشغيل التسلسل. ثم افتح الأداة ، وانقر فوق تهيئة وعندما يطلب منك ذلك ، قم بتثبيت محلول الغسيل رقم اثنين ، ومحلول الغسيل رقم واحد ، ومحلول المخزن المؤقت التلقائي للأس الهيدروجيني في أداة التسلسل.

بعد ذلك ، استمر في إجراء التهيئة وعندما يطلب منك ذلك ، أضف نيوكليوتيدات D-A-T-P-D-C-TP و DTTP إلى أنابيب 50 ملليلترا الخاصة بها. ثم قم بربط الأنابيب بآلة التسلسل واستمر في إجراء التهيئة. بمجرد اكتمال إجراء التهيئة ، ابدأ على الفور إجراء تحميل العينة لإعداد العينات للتسلسل.

الطرد المركزي الكرات المخصبة من مستحلب PCR عند 15 ، 500 مرة G لمدة 1.5 دقيقة لجمع الكرات في الجزء السفلي من الأنبوب. ثم قم بإزالة S natin واترك ثلاثة ميكرولتر بالضبط في الأنبوب. بعد ذلك ، أضف ثلاثة ميكرولترات من برايمر التسلسل إلى الأنبوب والماصة لأعلى ولأسفل لإعادة تعليق الجسيمات وخلط المحلول جيدا.

احتضان الأنبوب لمدة دقيقتين عند 95 درجة مئوية ، ثم لمدة دقيقتين عند 37 درجة مئوية. عند اكتمال الحضانة ، أضيفي ميكرولتر واحد من البوليميراز واخلطيهم جيدا ثم احتضن الخليط في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. أثناء احتضان الخليط ، قم بتحميل شريحة التسلسل على جهاز التسلسل وقم بإجراء فحص جودة الرقاقة.

ثم قم بإزالة السائل من الرقاقة باستخدام جهاز طرد مركزي سريع وجهاز طرد مركزي صغير. قم بتحميل العينة في الرقاقة عن طريق سحب سبعة ميكرولترات ببطء من مزيج كرة الإنزيم وتجنب إدخال الفقاعات في الشريحة. بمجرد تحميل العينة في الشريحة ، ضع الشريحة في الجهاز وابدأ تشغيل التسلسل.

لبدء تحليل البيانات ، اتصل بخادم بيانات التسلسل وقم بتنزيل ملف Q السريع. ثم قم بإنشاء علامة تبويب ، ملف oligos محدد يحتوي على معلومات التمهيدي والباركود. بعد ذلك ، قم بتنزيل الملفات المرجعية للجينات الخضراء من موقع الويب الأم ، وقم بتشغيل الأم ، وقم بإجراء التحليل.

قم بتحويل ملفات FASTQ إلى ملف سريع الجودة باستخدام الأمر الموضح في أسفل الشاشة. حدد عضوية المجموعة لكل تسلسل وقم بقص التسلسلات. باستخدام هذا الأمر ، ثم قم بتصنيف التسلسلات في تصنيف الجينات الخضراء.

باستخدام هذا الأمر ، يبلغ متوسط الإخراج عند التسلسل باستخدام ثلاث سفن 14 على سيل أيوني PGM حوالي 0.3 إلى 0.5 مليون. يقرأ بجودة جيدة بعد تصفية النتائج في الأم. فيما يلي تفصيل نموذجي لعدد القراءات بعد كل خطوة من إجراءات تسلسل الجيل التالي الموضحة هنا هو متوسط تكوين المجتمع على مستوى فئة الشعبة لجميع العينات البيئية ال 36 متعددة الإرسال التي تم تضخيمها باستخدام بادئات تستهدف منطقة V من ثلاثة إلى أربعة من الريبوسوم 16 ثانية وتحليلها باستخدام الأم سيد واحد.

يمكن إجراء هذه التقنية في غضون يومين إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تسلسل المتقدمين إلى الحمض النووي الريبي الريبوزومي 16 ثانية باستخدام آلة تسلسل على الطاولة.