فيفو السابقين الثقافة من ذبابة الفاكهة العذراء خصية واحدة ذكر الخراجات جرثومة خط: تشريح، التصوير، والمعالجة الدوائية

الهدف العام من هذا الإجراء هو إعداد ثقافات خارج الجسم الحي لذبابة الفاكهة وخصيتين التلاميذ وكيس السلالة الجرثومية لإجراء دراسات التصوير الحي والعلاجات المثبطة لتحليل ما بعد الانقسام العضلي لتكوين العضل ، يتم تحقيق ذلك عن طريق تشريح الخصيتين السليمتين أولا من أوائل بوي بعد 24 ساعة من تكوين بوريوم. الخطوة الثانية هي تشريح الأكياس الجرثومية المفردة من هذه الخصيتين ، ثم يمكن استخدام الخصيتين السليمتين والخراجات الجرثومية المفردة لتجارب التصوير الحي. بدلا من ذلك ، فإن الخطوة التالية هي احتضان الخصيتين السليمتين أو كيس السلالة الجرثومية بمركبات مثبطة.

في النهاية ، يتم استخدام التلوين المناعي للقرع والخصيتين والفحص المجهري الفلوري لمراقبة تأثير العلاج. الميزة الرئيسية لتقنية الثقافة خارج الجسم الحي هذه على الطرق الجينية الحالية هي أنها تسمح بالوصول إلى تكوين المنوية خلال مراحل ما بعد الانقسام الانقسامي. بشكل عام ، يعاني الأفراد الجدد على هذه الطريقة من النضال لأن بعض الخبرات تحتاج إلى تشريح أنسجة التلاميذ والتعامل معها.

لبدء التجربة ، قم بتوزيع قطرات من 80 ميكرولترا من الدروع و San M ثلاثة حشرات متوسطة مع مصل الأبقار الجنينية والمضادات الحيوية في طبق بتري بطول 10 سم. بعد ذلك ، باستخدام زوج عريض من الملقط ، اختر خادرة وانقلها إلى قطرة متوسطة على الطبق. ثم انقل المواد إلى مجهر استريو مزود بإضاءة ألياف ضوئية.

احرص على عدم تسخين الخصيتين فوق درجة حرارة الغرفة أثناء التشريح باستخدام ملقط رقم خمسة. أمسك الخادرة في أقصى نهايتها الخلفية واحتفظ بها في موضعها. أمسك الكرات الأمامية بزوج آخر من الملقط وافتح التلميذ تجعيدا في نهايته الأمامية.

انزع علبة التلميذ حتى ينكشف جزء على الأقل من الصدر. استمر في تثبيت الخادرة في موضعها من نهايتها الخلفية ، وحرر الضغط الداخلي للخادرة عن طريق إدخال ذراعي زوج من الملقط في منطقة رأس العذادرة. بعد ذلك ، قم بتمزيق الخادرة عن طريق فتح الملقط وتحريك الملقط في الاتجاه الأمامي وتأكد من أن الفتحة كبيرة قدر الإمكان في المحاولة الأولى.

تجنب إتلاف الخادرة في نهايتها الخلفية قبل تحرير الضغط. لأن هذا قد يؤدي إلى دفع الخصيتين مباشرة من خلال الفتحة الصغيرة وإتلافها. بمجرد فتح الخادرة ، يضغط الضغط الداخلي الذي تم إطلاقه للخادرة على كبيبات خلايا الجسم الدهنية والأنسجة من خلال الفتحة الكبيرة.

ثم قم بزيادة حجم الفتحة باستخدام زوج واحد من الملقط وتجنب الضغط على الخادرة بالملقط لأن ذلك قد يؤدي إلى تلف الخصيتين. بعد ذلك ، أمسك الخادرة في أقصى نهايتها الخلفية. الزوج الآخر من الملقط ويخرج محتويات الخادرة برفق من الخلف إلى الأمام لتحرير الخصيتين من الخادرة.

تحقق مما إذا كانت خصيتا التلميذ قد تم دفعها للخارج. لن يتم توصيلها بأي نسيج آخر. في غضون 24 ساعة ، يقوم PF بجمع الخصيتين بطرف ماصة مسبق القطع سعة 200 ميكرولتر.

انقل كمية صغيرة فقط من الوسط لتقليل عدد خلايا الجسم الدهنية التي تحمل الخصيتين. ثم ضع الخصيتين في وسط في طبق ثقافة طازج. اغسل الخصيتين عدة مرات بوسط حتى يبقى عدد قليل فقط من خلايا الجسم الدهنية للتصوير الحي.

انقل الخصيتين إلى طبق ثقافة ذو قاع زجاجي مع وسيط واستخدم مجهر تصوير مقلوب لبدء التشريح. انقل خصية واحدة أو أكثر من التلميذ إلى طبق ثقافة زجاجي مليء بالوسط. استخدم مجهر ستيريو مع إضاءة الألياف البصرية وإبرتين من الفولاذ المقاوم للصدأ لتشريح الخراجات الجرثومية الذكرية.

مع إبرة واحدة مثبتة بعناية ، خصية واحدة في نهايته الأمامية أو الخلفية وتثبيتها في موضعها. أدخل الإبرة الأخرى في الخصية وقم بتعطيل غمد الخصية عن طريق تحريك الإبرة جانبا ، مما يؤدي إلى إطلاق العديد من الخراجات. استمر في تثبيت الخصية في موضعها بإبرة واحدة.

ثم استخدم الإبرة الأخرى لإزالة الأكياس المتبقية من الخصية برفق. بعد ذلك الخراجات المجمعة المنفصلة. باستخدام طرف ماصة سعة 200 ميكرولتر عن طريق نقل الأكياس إلى طبق مزروع طازج مع متوسط.

ثم انقل الطبق المستزرع إلى مجهر تصوير مقلوب للتصوير الحي للأكياس المفردة. قم بتفريق الخراجات مرة أخرى بإبرة إذا لزم الأمر ، وحدد مرحلة الخراجات باستخدام تباين الطور والفحص المجهري الفلوري. ركز على كيس المرحلة المطلوبة.

تأكد من التركيز وموضع الكيس بشكل متكرر. أثناء تجارب التصوير الأطول ، لا تلتصق الخراجات بقاع طبق الثقافة. تنوي الخروج من التركيز.

املأ كل بئر من لوحة زراعة الخلايا المكونة من 24 بئرا ب 500 ميكرولتر من الوسط لتجربة واحدة من 12 تكرارا. ثم انقل خصية حدقة واحدة إلى كل بئر باستخدام طرف ماصة مقطوع مسبقا سعة 200 ميكرولتر. تحقق بعد ذلك من وجود البروتامين في الخصيتين المعزولين باستخدام مجهر مضان مقلوب.

يجب أن تكون الخصيتان خالية من البروتامين أو إشارة B-E-G-F-P ، مما يشير إلى أن التبديل بين البروتامين أو HP لم يحدث في أي من الخراجات. استبدل الخصيتين اللتين تظهر بالفعل الخراجات الإيجابية. أضف 500 ميكرولتر من الوسط الذي يحتوي على حمض إندو كاريك ، وهو المركب المثبط للوصول إلى تركيز نهائي يبلغ 150 ميكرومولار في مليلتر واحد لكل من أول 12 بئرا.

استخدم الآبار المتبقية كأدوات تحكم غير معالجة عن طريق إضافة 500 ميكرولتر من الوسط مع المذيب. ثم احتضن الطبق عند خمس درجات مئوية لمدة 24 ساعة في الظلام. تحقق مرة أخرى من وجود البروتامين في الخصيتين المحتضنتين.

يجب أن تظهر خصيتا التحكم الآن واحدا أو أكثر من الأكياس الإيجابية للبروتامين ، B-E-G-F-P ، مما يشير إلى الانتقال عبر مفتاح HP. بعد ذلك ، باستخدام ماصة ذات طرف 200 ميكرولتر ، انقل الخصيتين إلى شرائح مطلية ب بولي L لايسين. قم بإجراء مستحضرات الاسكواش وصمة عار بالأجسام المضادة الفلورسنت.

باتباع البروتوكولات المنشورة ، تم الحصول على صور تباين الطور لذبابة الفاكهة الخصيتين باستخدام طريقة التشريح هذه. هذه خصيتين كاملة مهروسة قليلا من ذبابة الفاكهة خادرة. بعد 24 ساعة من تكوين PY أو PF ، تقتصر المنوية على الطرف الأمامي أسفل منطقة المحور.

تمتلئ الخصية المتبقية بالخلايا المنوية المنوية في مرحلة نيفين الحالية مع نوى مستديرة منوية في مراحل استطالة مع تراكبات سوط متزايدة لتباين الطور ، تم الحصول على صور فلورية EGFP و RFP من خصيتين التلميذ المنزلي للكشف عن H اثنين A-V-D-R-F-P والبروتامين B-E-G-F-P في 24 ساعة PF. لم تخضع أي من المنوية لمفتاح HP بشكل متكرر. تحتوي الخصيتين اللتان تم تشريحهما في هذه المرحلة على بنية ذاتية التألق. تشريح خصية حدقة العين 36 ساعة يعرض PF أول كيس إيجابي للبروتامين ، B-E-G-F-P.

خصيتا التلميذ 48 ساعة يحتوي PF على العديد من الخراجات الجرثومية مع نوى إيجابية البروتامين المرئية. يمكن تسجيل الصور الحية بفاصل زمني خارج الجسم الحي للخصيتين بأكملهتين اللتين تتطوران في الثقافة. باستخدام هذه الطريقة ، تم تشريح خصية التلميذ لمدة 45 ساعة تم تحضين PF في وسط لمدة ست ساعات وتم تصويره كل خمس دقائق.

خلال هذا الإطار الزمني ، تظهر العديد من أكياس المنوية من مرحلة تبديل HP وتظهر إشارة بروتامين B-E-G-F-P الساطعة. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية الحصول على خصية التلميذ المبكرة وكيس الخط الجرثومي الفردي في الثقافة من أجل إجراء التصوير في الجسم الحي أو العلاجات المثبطة.