ل فيفو السابقين يسببها الليزر اصابات الحبل الشوكي نموذج لتقييم آليات محور عصبي تنكس في الوقت الحقيقي

الهدف العام للتجربة التالية هو تقييم آليات التنكس المحوري الحاد في الوقت الفعلي. يتم تحقيق ذلك عن طريق عزل الفخذ الأنسجة العصبية والحبل الشوكي الإيجابي YFP ، مع حشو الأنسجة باستمرار بالسائل الشوكي الدماغي الصناعي منخفض الكالسيوم المؤكسج. ثم يتم محاذاة أنسجة الحبل الشوكي تحت هدف مجهر الفوتون مع الحفاظ على الظروف الفسيولوجية ، ويتم تلطيخ المايلين بصبغة الفلورسنت المحبة للدهون النيل الأحمر.

بعد ذلك ، يتم إنشاء آفة بحجم ميكرو على السطح الظهري للعمود الظهري عن طريق ضبط طاقة الليزر من أجل تمرير المحاور النخاعية داخل الأعمدة. تظهر النتائج تراجع المحاور التالفة ، وتورم المايلين ، والاستجابات الخلوية الأخرى بناء على القياسات الكمية للصور. لذا فإن الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية هي أننا نستخدم الحبل الشوكي العنقي بالكامل وبالتالي تظل ألياف العمود الظهري سليمة.

لذلك هذا يتجنب تلف الألياف النخاعية المركزية الأساسية ، والتي تحدث عادة أثناء تحضير شريط المادة البيضاء. يوضح هذا الإجراء الدكتور ستارلين آدا ، زميل ما بعد الدكتوراه في مختبري الذي دافع حقا عن هذه التقنية للتحضير للتروية داخل القلب. اصنع السائل الشوكي الدماغي الصناعي منخفض الكالسيوم أو السائل النخاعي الدماغي باستخدام محاليل BNC المركزة مرتين لوفرة الحبل الشوكي خارج الجسم الحي.

أثناء التصوير ، قم بإعداد السائل الدماغي النخاعي العادي A مع محلولي مخزون مرتين A و B في زجاجة زجاجية. قدم هذه الحلول لدرجة الحموضة 7.4. حافظ على انخفاض الكالسيوم A السائل النخاعي مبردا بالقرب من منطقة التشريح واحتفظ بالسائل الدماغي النخاعي الطبيعي A في درجة حرارة الغرفة بالقرب من المجهر.

قم بفقاعة كلا المحاللين بالسيارة والغاز لمدة نصف ساعة قبل الاستخدام وقم بفقاعاتهما باستمرار أثناء استخدامهما. بعد ذلك ، قم بإعداد غرفة نضح الحمام المفتوح للتصوير. أولا ، قم بتوصيل الإخراج المعدني للسخانات المضمنة بالغرفة.

ثم قم بلصق غرفة التصوير بغرفة الانسكاب بكمية جيدة من المواد اللزجة بحيث يكون هناك إمكانية لضبط موضع غرفة التصوير قليلا. قم بتأمين مسبار درجة حرارة التغذية المرتدة للسخانات المضمنة بالقرب من مدخل السوائل وقم بتأمين أنبوب الشفط المصنوع من الفولاذ المقاوم للصدأ بخط التفريغ عند مخرج الغرفة. الآن قم بتشغيل مضخة التفريغ ومضخة التروية.

بمجرد أن تمتلئ الغرفة ب A CSF ، اطلب المضخة إلى 1.5 إلى ملليلترين في الدقيقة. ثم تحكم في حجم A CF في الغرفة من خلال موضع خط التفريغ. لضبط القتل الرحيم من ستة إلى 10 أسابيع TH واحد YFP الماوس المعدل وراثيا.

أولا ، تأكد من عدم وجود استجابة انعكاسية لقرصة إصبع القدم. ثم احلق المنطقة التي تغطي الحبل الشوكي والدماغ. بعد الحلاقة ، امسح الجلد المكشوف بالبيتادين و 70٪ الإيثانول.

الآن رش منطقة الصدر والبطن بنسبة 70٪ من الإيثانول وقم ببث كاردي الحيواني مع فقاعات منخفضة الكالسيوم A CSF. عندما يبدأ الكبد في الشحوب ، قم بتوصيل إبرة التروية بالقلب بمشبك. ثم اقلب وامسح جانب الجلد الظهري بنسبة 70٪ من الإيثانول.

قم بعمل شق على طول خط الوسط من الأنف إلى الورك لكشف غطاء الجمجمة والأنسجة فوق الفقرات. استخدم المسامير لسحب الجلد جانبا وتأمين عند الأنف. الآن انقل المستحضر إلى مجهر تشريح هناك باستخدام مقص مقطوع بإحكام عبر السطح الظهري للجمجمة على مستوى المصابيح الشمية.

أدخل طرف المقص في الشق الذي تم إجراؤه حديثا وقم بقصه على طول حواف غطاء الجمجمة لكشف المخيخ. لا تقم باستئصال غطاء الجمجمة تماما. ارفع غطاء الجمجمة لتعريض الدماغ وقم بقص الحواف اليسرى واليمنى للعظم الجداري بعناية فوق

الآن ، أثناء سحب غطاء الجمجمة وسطح العمود الفقري الظهري برفق ، قم بعمل جروح أدنى من جذور الأعصاب الخلفية لكشف الحبل الشوكي بشكل أكبر. ثم باستخدام مقص ذو رأس ناعم ، قم بقص الفقرات بعناية بشكل ثنائي. بزاوية 45 درجة ، من الضروري تجنب تلف الأعمدة الظهرية.

تتلف هذه الألياف البيضاء الزاهية بسهولة دون توخي الحذر ، وتستمر في سحب العظام والعضلات المستقرة برفق أثناء قطع الفقرات. قطع سنتيمترات إلى سنتيمترين لعزل جزء من أنسجة الحبل الشوكي العنقي المناسب للتصوير. ثم استخدم المقص لقطع الأنسجة والعظام بالتوازي مع العمود الفقري.

أيضا بتنظيف الأنسجة الموجودة أسفل العمود. اجعل هذه التخفيضات على مستوى قدر الإمكان لأنه من المهم جدا أن يكون النسيج مسطحا في مستوى الغرفة للتصوير. أخيرا ، استخدم المشرط رقم 11 لتمرير جذع الدماغ بعد إنهاء ألياف العشب وعند المستوى الصدري العلوي.

ثم استخدم المقص لقطع الأنسجة والعظام في هاتين النقطتين. يجب أن يحتوي النسيج المعزول على ثلثي العمود الفقري الذي يشمل جذع الدماغ الحري وتضخم عنق الرحم والحبل الشوكي الصدري العلوي. انقل العمود الفقري المعزول إلى غرفة التصوير خارج الجسم الحي وقم بزيادة درجة حرارة الثماني تدريجيا إلى ما بين 36 و 37 درجة مئوية خلال الساعة التالية.

حافظ على درجة الحرارة هذه أثناء التصوير. يتمثل أحد الجوانب المهمة لهذا البروتوكول في التأكد من عزل الحبل الشوكي دون الإضرار بألياف العمود الظهري. الجانب الثاني الأكثر أهمية في هذا البروتوكول هو التأكد من أن الحبل الشوكي مليء باستمرار بالسائل النخاعي الدماغي الاصطناعي المؤكسج.

باستخدام حامل منزلق الأنسجة المعدل ، قم بتأمين العمود الفقري بعناية في الغرفة. من المهم تجنب لمس الحبل الشوكي المكشوف أو الأعمدة الظهرية أو الضغط عليها بخيوط خيوط الإعجاب. الآن لتلطيخ المايلين ، أوقف تدفق المحلول لفترة وجيزة وقم بإزالة خط التفريغ.

أضف خمسة إلى 10 ميكرولترات من صبغة النيل الحمراء خمسة ملليمولار بالقرب من الطرف الحبلي للحبل الشوكي. ثم امزج المحلول برفق في جميع أنحاء غرفة التصوير واترك الأنسجة تحتضن لمدة دقيقة أو دقيقتين. بمجرد تلطيخها ، أعد تدفق السائل النخاعي المؤكسج إلى ما بين 1.5 و ملليلترين في الدقيقة واستبدل خط التفريغ باستخدام مجهر ضوئي.

قم بتصوير الحبل الشوكي باستخدام هدف الغمر في الماء. اخفض الهدف ببطء إلى سطح السائل الدماغي النخاعي A ، ثم اجعل الحبل الشوكي في بؤرة التركيز تحت ضوء فلورسنت AF. انتقل الآن إلى وضع المسح للتصوير الأساسي للعشب الصاعد.

ألياف Oculus النخاعي. لإثارة YFP والأحمر النيلي ، اضبط الإثارة على 950 نانومتر وعزل انبعاثات الفلورسنت باستخدام مرشحات DI المزمنة وتمرير الانحناء. إذا لاحظت في غضون ساعة من التصوير أن أكثر من 3٪ من المحاور تحتوي على ستيرويدات ، فهذا يعني أن الحبل الشوكي قد تضرر أثناء العزل.

من الأفضل الآن التخلص من المستحضر لإصابة الأنسجة بالليزر. أولا ، حدد موقع منطقة من الأنسجة تبدو مستوية. ثم قم بزيادة تكبير منطقة العرض إلى 30.3 ضعفا.

اضبط الليزر على 800 نانومتر وقم بزيادة قوته إلى حوالي 110 مللي واط. الآن قم بإجراء خمس عمليات مسح بالليزر في مجال الرؤية. يجب أن تكون النتائج استئصال كامل بقطر 20 ميكرون.

تحقق من الإصابة في إعدادات التصوير القياسية باستخدام الليزر عند 17 مللي واط وتكبير 20.08 ×. إذا لم يتم تمرير الألياف المحورية عند الاستئصال بالكامل ، فتخلص من المستحضر. الآن ، استخدم إعدادات الفاصل الزمني مع لقطات Z لعمل تسجيلات استجابة ديناميكية للإصابة.

يمكن تصوير المستحضر لمدة تصل إلى 24 ساعة. تم عزل جزء من الحبل الشوكي ووضعه كما هو موضح في خط الأساس T-P-L-S-M. يظهر التسجيل الساكسونيين المفصليين العشبيين النخاعي كمحاور إيجابية YFP محاذاة متوازية في غمد الدينار الملون باللون الأحمر مع القليل من الستيرويدات المحورية أو العلامات المورفولوجية الأخرى للتنكس المحوري.

يمكن رؤية التفاصيل الدقيقة مثل أنف ROM VA الذي أبرزته رؤوس الأسهم. بعد 40 دقيقة بعد إصابة الحبل الشوكي الناجم عن الليزر. تشكل معظم المحاور المتقاطعة بصيلات طرفية محورية مميزة وتتراجع عن موقع الإصابة ، وتخضع المحاور المجاورة لموقع الإصابة للتنكس الثانوي وأصبح التورم المحوري أكثر بروزا.

على عكس الألياف الفصلية المتراجع ، تم تصنيف معظم المصابيح المحورية المتراجع الموجودة بعيدا عن الآفة والمنشطات بقوة باللون الأحمر النيلي مما يشير إلى حدوث تغيير بيئي داخل المحور العصبي. في سبع ساعات ، استمرت المحاور في التراجع بعيدا عن موقع الآفة. ومع ذلك ، فإن هذا أكثر وضوحا في المصابيح النهائية الموجودة بعيدا أو منقاريا عن الآفة منه في المصابيح الطرفية الموجودة بالقرب من الآفة.

في النهاية ، خضعت المحاور التي تم تجنيبها في البداية تدريجيا للتنكس الثانوي المتأخر. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية عزل الحبل الشوكي العصبي وإجراء إصابة في الحبل الشوكي الناجم عن الليزر. لذلك ، ستتمكن من فحص الجوانب الديناميكية لكل من التنكس المحوري الأولي والثانوي في الوقت الفعلي.

قد تؤدي المعلومات المكتسبة من استخدام هذا النظام النموذجي إلى فهم ميكانيكي مهم لكل من تلف المحور العصبي والمايلين بعد الإصابة.