الثقافة والمشارك ثقافة ماوس المبايض وحويصلات المبيض

الهدف العام من هذا الإجراء هو نمو المبايض حديثي الولادة و / أو بصيلات المبيض الفردية في المختبر. يتم تحقيق ذلك عن طريق تشريح المبايض أولا من الإناث الباردة في العمر المناسب. الخطوة الثانية هي تحضير الأنسجة ، بما في ذلك التشريح الدقيق لبصيلات المبيض الفردية بإبر الوخز بالإبر.

ثم يتم زراعة المبايض حديثي الولادة أو بصيلات ما قبل الجنائية الفردية بالتغذية المنتظمة ، والخطوة الأخيرة هي إصلاح أو تجميد الأنسجة للتحليل النسيجي أو الجزيئي. في النهاية ، يدعم نظام الثقافة التطور بطريقة فسيولوجية للغاية ويمكن استخدامه لفحص تنظيم نمو بصيلات المبيض والتحقيق في التفاعلات بين بصيلات المبيض البدائية والنامية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أن بصيلات المبيض السليمة مدعومة من خلال نمو البصيلات ، مما يحافظ على هيكلها ثلاثي الأبعاد دون الحاجة إلى مصفوفات داعمة.

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال بيولوجيا المبيض ، وأيضا للمساعدة في التحقيق في آثار المركبات السامة مثل العلاج الكيميائي والأدوية على المبيض ، وبالتالي خصوبة الإناث. خطرت لنا لأول مرة فكرة الزراعة المشتركة للأعمار المختلفة وبالتالي مراحل بصيلات المبيض عند مناقشة كيفية التحقيق في آثار البصيلات النامية على بركة البصيلات البدائية المريحة ، وسيتم توضيح هذه التقنية جنبا إلى جنب مع ستيف مورغان وليزا كامبل فيفيان أليسون ، فني من المختبر وأليسون موراي ، التي كانت عالمة ما بعد الدكتوراه في المختبر لسنوات عديدة. ساعد كلاهما في تطوير الجوانب الرئيسية لتقنية سحب الماصات لهذا البروتوكول.

قم بتسخين الماصات الزجاجية وثنيها على اللهب وقم بعمل قطع نظيف باستخدام قاطع الزجاج. ثم قم بتعقيم الزجاج المنحني عند 160 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة تقريبا. يتطلب الأمر تدريبا للحصول على المنحنى الصحيح في الماصة لتقنيتك.

قم دائما بقص الماصة بقاطع زجاجي حتى لا يكون هناك زجاج خشن. تريد أيضا التأكد من أن لديك القطر المناسب لأنسجتك مصمم لتعقيم وسط التشريح المصنوع من وسط lebowitz L 15 مع BSA من خلال مرشح 0.2 ميكرون. يبلغ قطره 25 ملم مصمم لتعقيم مزرعة المبيض لحديثي الولادة.

متوسط من خلال مرشح آخر 0.2 ميكرون قطره 25 ملم فقط وجمعه في أنبوب معقم. ثم أضف ملليلتر واحد من وسط حديثي الولادة إلى كل بئر من 24. صفيحة جيدة ونقل الغشاء على سطح الوسط في كل بئر.

أيضا تعقيم وسط ثقافة البصيلات بالترشيح مثل وسط زراعة المبيض. ثم يجب تعقيم زيت السيليكون بفلتر أيضا. بعد ذلك ، قم بإصلاح 96 لوحة ثقافة بئر ب 30 قطرة ميكرولتر من وسط المسام على طول الصف العلوي.

بتراكب هذه الآبار بعناية ب 70 ميكرولتر من زيت السيليكون. بدلا من ذلك ، تتطلب الزراعة المشتركة لبصيلات الجريب 100 ميكرولتر من الوسط مع تراكب من 100 ميكرولتر من زيت السيليكون. ثم قم بإعداد ألواح الزراعة المشتركة لمبيض الجريب مع ملليلتر واحد من الوسط لكل بئر وغشاء نواوي معقم بالأشعة فوق البنفسجية بعناية فائقة.

ابدأ بنقل ملليلتر واحد من وسط التشريح إلى كل طبق جنين زجاجي معقم. بعد تلوين الجراء البالغة من العمر من صفر إلى خمسة أيام بعد الولادة ، أمسك الجلد الذي يغطي جدار البطن بالملقط الناعم وقم بتقطيع الجلد وجدار الجسم. اسحب هذا الشق الكبير الذي يكشف البطن.

عادة ما تكون المثانة محتقنة في هذه المرحلة ويمكن ثقبها لتسهيل التشريح. باستخدام ملقط صانع الساعات ، حرك الشجاعة جانبا. ثم على كلا الجانبين ، اتبع قرون الرحم من المثانة إلى الكلى.

المبيض عبارة عن بنية تشبه السحابة تقع أسفل الكلية مباشرة في الجزء العلوي من الرحم. أمسك المبيض برفق وباستخدام المقص. اقطعها من الرحم.

بعد تشريح كلا المبيضين ، انقلهما إلى أطباق مليئة بالتشريح الدافئ. متوسط. استخدم مجهر تشريح بمرحلة تسخين عند 37 درجة مئوية لتشريح المبايض باستخدام إبر الأنسولين. قم بقص الكيس القاعدي وأي مواد زائدة ، بما في ذلك قناة فالوب حتى يبقى المبيض فقط.

ثم انقل كل مبيض إلى بئر الصفيحة المعدة باستخدام ماصة منحنية. ضع مبيضا واحدا على كل ثقافة غشائية ، حيث يتغير النسيج نصف الوسط كل يومين لمدة تصل إلى ستة أيام عند تغيير الوسط ، ضع طرف الماصة على حافة البئر المتوسط لتجنب إزعاج الغشاء. بعد الزراعة ، يمكن تخزين المبايض مجمدة أو ثابتة أو نسيجية أو كيمياء مناعية.

بعد جمع المبايض من الفئران الأكبر سنا في طبق من وسط التشريح الدافئ ، قم بإزالة الباسا المبيض. استخدم إبر الأنسولين لتقليم الكيس القاعدي وأي مواد زائدة ، بما في ذلك قناة فالوب حتى يبقى المبيض فقط. ثم اقطع المبايض إلى نصفين باستخدام الإبر وانقل كل نصف بعناية إلى زجاج ساعة فردي يحتوي على مليلتر واحد من وسط التشريح.

قم بتغطية نظارات الساعة بشريحة زجاجية وقم بتخزينها في الفرن لمدة تصل إلى ساعة في أسرع وقت ممكن. من خلال العمل تحت المجهر بمرحلة ساخنة في غطاء تدفق الصفيحة ، قم بتشريح المبايض إلى قطع كبيرة باستخدام إبر الأنسولين لتحديد بصيلات ما قبل الأنطل المتأخرة. تحتوي بصيلات ما قبل الجمل على طبقتين إلى ثلاث طبقات من خلايا التسمم المحبب ويبلغ قطرها حوالي 180 إلى 200 ميكرومتر.

قم بتشريح أي منها باستخدام إبرة مضمنة وإبرة للوخز بالإبر مثبتة بحامل إبرة ، وتجنب إتلاف الصفيحة القاعدية ، ولكن تأكد من إزالة السدى المحيط. هذا يتطلب ممارسة. تحتاج المسام إلى بعض الأنسجة البرازية ، ولكن ليس كثيرا.

أيضا ، إذا كانت عملية التشريح قاسية جدا ، فإن المسام يتلف وإما يتمزق أو يموت. أثناء الاستزراع ، أعد المستخدم perpe لنقل البصيلات بعناية إلى زجاج ساعة جديد مملوء بوسط. احتفظ بالبصيلات على الجزء الرفيع من البيربيت باستخدام عدسة معايرة مثبتة على مجهر تشريح.

قياس البصيلات. إذا كانت في حدود 10 ميكرومتر من قطرها 190 ميكرومتر. يمكن استخدامها للزراعة ، والتخلص من البصيلات الأخرى من البصيلات المحددة.

اختر فقط الأكثر صحة للثقافة. يجب أن تكون شفافة بدون مناطق شبكية داكنة لها رقائق قاعدية سليمة وبعض الأنسجة المتصلة. العائد الجيد هو 10 إلى 15 بصيلة لكل مبيض.

الآن باستخدام بيربي منحني محضر ، انقل هذه البصيلات إلى لوحة ثقافة 96 بئر محضرة. ضع بصيلات واحدة في كل بئر أسفل طبقة الزيت والثقافة. تصل البصيلات إلى ستة أيام كل يوم.

قم بإعداد صف جديد باستخدام الوسائط. بعد ساعة أو أكثر ، انقل البصيلات إلى الصف التالي من الوسائط المتوازنة الطازجة أو ثقافات بصيلات البصيلات المشارقة لزراعة بصيلات جنبا إلى جنب في واحد. حسنا ، بدلا من النقل ، استخدم طرفا ناعما من الجل لتغيير نصف الوسيط كل يومين.

بالنسبة لمبيض الجريب ، تنقل المزارع المشتركة جريب إلى مبيض حديث الولادة يوضع على غشاء في صفيحة مزرعة ، ويضع المسام بعناية بجانب أحد عمود مبيض المبيض الوليدي بحيث يمكن بعد ذلك نقلهما إلى ملامسة بعضهما البعض. حافظ على هذه الثقافة لمدة تصل إلى خمسة أيام. استبدال 500 ميكرولتر من الوسط كل يومين.

غالبا ما يتم تغليف بصيلات ما قبل الجمل الجنائي بواسطة المبايض حديثي الولادة. خلال هذه المزرعة ، تم استزراع المبايض حديثي الولادة من حديثي الولادة لمدة ستة أيام وتعرضت للمواد السامة التناسلية. في اليوم الثاني من الثقافة ، تمت معالجة الأنسجة لتحديد عدد وصحة المراحل المختلفة من البصيلات.

كان أحد المواد السامة التي تم التحقيق فيها هو سيسبلاتين. المادة السامة الأخرى التي تم التحقيق فيها هي دوكسوروبيسين. بحثت تجربة مختلفة في تأثير الهرمون المنبه لبصيلات موجهة الغدد التناسلية والهرمون اللوتيني على نمو البصيلات الفردية.

ولكن تم قياس حجم بصيلات التحليل هذا بشكل دوري لرسم خريطة لنموها. تم التحقيق في الزراعة المشتركة لجريب الجريب باستخدام A GFP الذي يعبر عن جريب وتمتد عمليات البصيلات من النوع البري من واحدة إلى أخرى. كشفت المعالجة الكيميائية المناعية لهذه الثقافة المشتركة أن عمليات GFP تكمن ضمن الأنواع البرية.

الطبقة الثالية ، المبايض حديثي الولادة من النوع البري أيضا مزرعة مشتركة مع GFP التي تعبر عن البصيلات. في هذا السيناريو ، انتقلت عمليات GFP عبر الخلال المبيضي. تعد مزرعة المبيض عند حديثي الولادة طريقة مباشرة تماما ، ولكن توقع قضاء بعض الوقت في إتقان تقنية تشريح بصيلات ما قبل الأنفية السليمة غير التالفة.

هذا ضروري لتطورها السليم. بعد زراعة البصيلات ، يمكن تخصيب البويضات عن طريق الإخصاب في المختبر ، وبعد ذلك يمكن نقل الأجنة إلى إناث حوامل زائفة والحصول على صغار أحياء.