في فيفو وفيفو السابقين المداخل لدراسة سرطان المبيض النقيلي الاستعمار من الهياكل التبانة بقعة في البريتوني الدهنية

الهدف العام من هذا الإجراء هو إثبات استخدام التقنيات القياسية لقياس استعمار سرطان المبيض في مستودعات الدهون البريتونية. يتم تحقيق ذلك من خلال الحقن داخل الصفاق لخلايا سرطان المبيض في الفئران بعد التضحية بالفئران في نقاط زمنية محددة. يتم تحديد مستودعات الدهون البريتونية وعزلها عن الفئران.

أخيرا ، يتم تحديد عدد خلايا سرطان المبيض الموجودة في مستودعات دهنية محددة باستخدام قياس التدفق الخلوي. بالإضافة إلى الدراسات القائمة على الآلية ، يمكن أيضا دراسة استعمار خلايا سرطان المبيض في الزراعة المشتركة خارج الجسم الحي ، متبوعة بالتحليلات الكمية أو الجزيئية المناسبة. في النهاية ، تتيح هذه الأساليب في الجسم الحي وخارج الجسم الحي استجواب العمليات المشاركة في استعمار خلايا سرطان المبيض للدهون البريتونية عبر طرق نوعية أو كمية.

الميزة الرئيسية لهذا النهج هي أننا قادرون على تنفيذ تقنيات قياسية لتقييم خطوات محددة في الاستعمار النقيلي لسرطان ovt للدهون الصفاقية. الآثار المترتبة على هذه التقنية تمتد من الوقاية من ورم خبيث. على وجه التحديد ، فإنه يتيح تحديد تفاعلات البيئة المكروية للخلايا السرطانية التي تنظم نمو خلايا سرطان المبيض داخل الخلايا المناعية التي تحتوي على هياكل تعرف باسم البقع اللبني.

بشكل عام ، سيجد الأفراد الجدد في هذه الطريقة أنه من المفيد أن يكون لديهم خبرة في التعامل مع الفئران. على الرغم من أن الحقن داخل الصفاق تبدو واضحة ، إلا أن الافتقار إلى تقنية جيدة يمكن أن يؤدي إلى بيانات غير دقيقة. علاوة على ذلك ، يتطلب تفكك الأنسجة إلى تعليق الخلية المفردة ممارسة وتخطيطا دقيقا قبل بدء التجربة.

هذه التقنية بالذات لا تتطلب أن تكون تحت التخدير. بموجب البروتوكولات المعتمدة ، قم بإجراء هذه التقنية على الحية. قم بتحميل 500 ميكرولتر من نظام التعليق أحادي الخلية الموسوم بالفلورسنت في المحقنة.

ثم ضع المحقنة في إبرة معقمة مقاس 25 لتقليل قص الخلايا قبل الحقن. قم بتقييد الماوس باليد الأخرى ، والتقط الماوس من قفص الرقبة وامسك الذيل باستخدام راحة اليد والسبابة. ثم قم بتثبيت الساق الخلفية اليسرى بين الخاتم والإصبع الصغير لتجنب صدمة أعضاء البطن.

كبح الماوس جيدا حتى لا يتحرك أثناء الحقن. تخيل خطا عبر البطن وحدد نقطة على الجانب الأيمن من وبالقرب من خط الوسط. نقطة الدخول هي الجمجمة الثانية والوسطى قليلا من الحلمة الأخيرة.

استعد لإدخال الإبرة على الجانب الأيمن من الفأر لتجنب الأعور وتقليل خطر ثقب الأمعاء. أدخل الإبرة في المنطقة الجانبية السفلية من بطن الفأر على عمق 0.5 سم تقريبا. اسحب المكبس للخلف للتأكد من أن الإبرة لم تخترق الأوعية الدموية أو الأعضاء البريتونية الأخرى.

إذا لم يتم شفط أي سائل ، فقم بحقن العينة باستخدام ضغط بطيء وثابت. ثم اسحب الإبرة وأعد الماوس إلى قفصه. لا تقم بتجميع المحقنة قبل التخلص منها في حاوية الأدوات الحادة.

التضحية بالفئران في نقاط زمنية محددة بعد الحقن لإزالة الأعضاء الحيوية. كما هو موضح في بروتوكول النص ، فإن حصاد مستودعات الدهون البريتونية يشكل إزالة الأعضاء الداخلية. قم بعمل شق خط الوسط بالقرب من الفتحة الأربية من خلال الجدار البريتوني لفضح الأعضاء الداخلية لاستئصال الدهون العقلية.

تعريض مركب البنكرياس الرمي عن طريق تمديد الطحال من التجويف البريتوني باستخدام ملقط لدهون الغدد التناسلية. استخدم الملقط لرفع دهون الغدد التناسلية المحيطة بالمبايض واستئصالها عن طريق قطع وصلات الأنسجة. فورا. ضع المناديل في PBS المثلج.

بعد ذلك ، قم بإزالة دهون الرحم باستخدام ملقط لرفع دهون الرحم المحيطة بقرون الرحم والاستئصال عن طريق قطع وصلات الأنسجة قبل وضع الأنسجة على الفور في PBS المثلج. عند الحصول على الدهون المساريقية ، اقطع الوصلة بين الأمعاء الدقيقة والبواب. استخدم الملقط لإمساك الطرف الحر للأمعاء الدقيقة بإحكام وتقشيره ببطء بعيدا عن دهون المساريق.

حرر الدهون المساريقية من جذر المساريقية باستخدام مقص التشريح. ثم ضع الأنسجة على الفور في برنامج تلفزيوني مثلج بارد. أخيرا ، لإزالة الدهون البابية pleo ، ارفع الطرف البعيد من الطحال باستخدام ملقط لفضح الشريط الدهني الرفيع للأنسجة ، وربط نقير الطحال بالبنكرياس.

استئصال الدهون بوابة pleo عن طريق إطلاقها أولا من البنكرياس ثم تشريحها بعناية من الطحال. ثم ضع الأنسجة على الفور في PBS لبدء الوزن. تطابق جميع الأنسجة الدهنية مع الثرب.

نقل الأنسجة لفصل خمسة أنابيب ملليلتر تحتوي على 1.5 مل من ECCOs الخالية من المصل ، ووسط النسور المعدلة أو DMEM و 0.1٪ زلاليم مصل البقر. قم بتجميع الأنسجة التي تم حصادها من ثلاثة فئران مستقلة لضمان عائد كاف من الخلايا لقياس التدفق الخلوي. بعد ذلك ، قم بفرم الأنسجة باستخدام مقص جراحي وأضف 1.5 مل من DMEM الخالي من المصل الذي يحتوي على 0.4٪ كولاجيناز واحد.

احتضان تعليق الأنسجة عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة مع الخلط الدوراني كخطوة اختيارية. مزيد من فصل الأنسجة عن طريق المضغ. في هذه الحالة ، انقل تعليق الكولاجيناز الأنسجيكي إلى معدة أو كيس صغير ومضغ لمدة 10 دقائق على نار منخفضة ، مع تدوير اتجاه الأكياس بعد خمس دقائق.

بعد ذلك ، قم بتصفية العينات من خلال مرشح شبكي من النايلون لإزالة الحطام الكبير. اجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي عند 250 مرة G لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية وتخلص من الجزء الطافي. أعد تعليق حبيبات الخلية في 100 ميكرولتر من PBS جنبا إلى جنب مع 900 ميكرولتر من كلوريد الأمونيوم ، تحلل البوتاسيوم ، العازلة ، واحتضانها في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقة واحدة.

ثم قم بالطرد المركزي للخلايا مرة أخرى كما كان من قبل وتخلص من المادة الطافية بعد إعادة التشكيل ، مع تعليق حبيبات الخلية في 250 ميكرولتر من PBS المثلج ، قم بتصفية العينات من خلال شبكة نايلون صب 60 ميكرون لضمان تعليق خلية واحدة. ثم اشطف الفلتر ب 250 ميكرولتر من PBS المثلج البارد ينمو وقم بإعداد الخلايا ذات العلامات الفلورية وإعادة التأهيل. تعليق بتركيز 2 مليون خلية لكل ملليلتر.

ضع ما يقرب من ستة ميكرولترات من لاصق الأنسجة على غشاء الثقافة. أدخله واتركه يجف في الهواء. ثم اغسل الغشاء مرتين بالماء المعقم لإزالة أي مادة لاصقة زائدة قبل تجفيف الأغشية بالهواء تحت غطاء رقائقي ، قم باستئصال الزراعة العضوية بعناية وإرفاقها بالغشاء المطلي بالمادة اللاصقة باستخدام ملقط معقم.

بعد السماح للأنسجة بالالتصاق بالغشاء لمدة دقيقة واحدة ، أضف 500 ميكرولتر من تعليق الخلية فوق كل شرب في كل إدراج مزرعة. ثم املأ المنطقة المحيطة بغرفة البتحال ب 2.5 مل من وسائط DMEF 12. احتضان الزراعة العضوية مع تعليق الخلية لمدة ست ساعات عند 37 درجة مئوية في بيئة 5٪ CO2.

قم بإزالة وغسل الزراعة العضوية بعناية بحوالي 10 مل من PBS. أخيرا ، تصور بؤر الخلايا السرطانية الفلورية باستخدام نظام تصوير الفلورسنت المناسب. يمكن رؤية المواقع النسبية لمستودعات الدهون البريتونية عن طريق التشريح التشريحي الإجمالي.

تظهر هنا نظرة فاحصة على بوابة Pleo والدهون العقلية. يتم عرض الأحجام النسبية لمستودعات الدهون المستقطأة هنا. لوحظت البقع اللبنية في الدهون الباطلة والبوابة البنيوية باستخدام الأنسجة القياسية.

يتم عرض النتائج الكمية من تحليل التدفق لمستودعات الدهون البريتونية المختلفة. يتم عرض معايير البوابات للتحليلات هنا. تم استخدام الخلايا الأبوية الفكرية كعنصر تحكم سلبي.

احتوت مستحضرات الأنسجة العقلية على عدد كبير من الخلايا الإيجابية للطماطم TD بالنسبة إلى دهون المساريق والغدد التناسلية الرحمية. في بيانات قياس التدفق الخلوي الكمي ، يتم التعبير عنها كمتوسط زيادة في تغيير الطية للأحداث الإيجابية لطماطم TD بالنسبة للفئران المحقونة PBS في الجسم الحي والاستعمار خارج الجسم الحي ل OA بواسطة SKV ثلاثة ، IP واحد GFP يظهر خلايا سرطان المبيض هنا. أظهر التصوير الفلوري للالتهاب العضوي الكامل أنماط استعمار مماثلة لتوطين الخلايا السرطانية في كل من فحوصات الجسم الحي وخارج الجسم الحي.

أكد الفحص النسيجي لهذه الأنسجة وجود خلايا سرطانية موضعية في البقع اللبني. أخيرا ، يؤكد الكشف الكيميائي المناعي للسيتوكيراتين المعبر عنه بواسطة SKO V ثلاث خلايا IP واحدة GFP هذه النتائج النسيجية. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر تحديد الأنسجة الدهنية البريتونية واستئصالها بعناية ومنع التلوث بأنواع الأنسجة الأخرى ، والتي ستؤدي بعد ذلك إلى تحريف البيانات الكمية التي تم الحصول عليها من قياس التدفق الخلوي.

الشيء الثاني ، من المهم أن تتذكر اختيار سلالاتي المناسبة للدراسة المعنية. يمكن استخدام هذه التقنية لتحديد تفاعلات خطوط خلايا سرطان المبيض الراسخة في البيئة المكروية للثرب والتي تعتبر مهمة لتكوين ورم خبيث. يمكن استخدامه أيضا لتقييم الإمكانات الخبيثة لخطوط الخلايا التي تصمم الآفات المبكرة التي تظهر في قناتي فالوب.