القيطم المورق نموذجا لتحديد الترجمة انخفاض قيمة

الهدف العام من هذا الإجراء هو تقييم العواقب الأولى للطفرات في عوامل بدء الترجمة دون تدخل mRNA المكتوب حديثا أو مشاكل كفاءة التعدي التي تحدث غالبا مع دراسات الخلايا حقيقية النواة. يتم تحقيق ذلك عن طريق تصنيع النوع البري المتحور والتحكم أولا ، أو GFP mRNA من البلازميدات المقابلة. يتم حقن الحمض النووي الريبي المركب التالي في خلايا XUS Lavis في المرحلة السادسة ، ويتم تحفيز نضجها باستخدام هرمون البروجسترون.

ثم يتم تقييم نضوج الخلايا عن طريق تصور انهيار الحويصلة الجرثومية ويتم تحليل بعض مكونات سلسلة MA kinase التي يعتمد تنشيطها على تعبير بروتين الطحالب بواسطة اللطخة الغربية. أخيرا ، تتم دراسة عديد الأدينيل mRNA للطحالب والحمض النووي الريبي المرسال الأخرى اللازمة للتعافي من عضل خلايا XPO. في نهاية المطاف نضوج الخلايا الحركية.

تستخدم تحليلات اللطخة الغربية والبولي الأدينيل لإظهار التأثير المحتمل لتعبير البروتين عند تحور عامل بدء الترجمة. الميزة الرئيسية لهذه التقنية على أساليبنا الحالية أو النظام الخلوي المعاد تشكيله المستخرج بالتساوي مع الخلايا الشبكية الجرثومية أو الأرانب ، هي أن تأثيرات الطفرة التي تم إدخالها في التصوير بالرنين المغناطيسي. سيتم ملاحظة NA بسرعة ودراسته بسهولة في العديد من ضرائب xop. Cytes بشكل عام.

يتميز هذا النموذج بمزايا البساطة مع خلاياه العملاقة المفردة ، ويؤدي استخدامه إلى كمية كبيرة من المواد للتجارب الكيميائية الحيوية. هذه العملية فعالة أيضا من حيث الوقت مقارنة بتوليد خط الخلايا المستقر. يمكن أن يساعد هذا الميسو في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في دراسات الترجمة مثل فهم دور مجالات معينة من عوامل الترجمة بشكل أفضل أو لدراسة ربط هذه العوامل.

نضيف أولا فكرة هذه الطريقة عندما أردنا دراسة تأثير عامل بدء الترجمة المتحولة على تخليق البروتين دون تدخل في النسخ. بهذه الطريقة ، نتجنب حلقات التغذية الراجعة المحتملة بين هاتين الآليتين الآليتين. في الواقع ، يتم تخزين نسخة المواد ووضعها.

يمكن تشغيل الترجمة باستخدام هرمون البروجسترون بعد التغوط ، xus lavos cytes وإعداد CRN وفقا لبروتوكول النص ، استخدم 10 × مماسح و 6.6٪ فورمالديهايد لصب هلام AROS بنسبة 1.5٪. تحضير العينات في أنبوب 0.2 مل مع 8.8٪ فورمالديهايد ، 60 بالمائة ل AMIDE 0.1 أحجام من 10 × مماسح وميكرولتر واحد من CRNA تحتضن عند 70 درجة مئوية لمدة ثلاث دقائق ووضع الأنابيب على الجليد لمدة 10 دقائق. الطرد المركزي للعينات عند 5 ، 000 مرة G لبضع ثوان قبل إضافة ميكرولترين من المخزن المؤقت لتحميل الجل.

قم بتشغيل العينات بجهد 90 فولت لمدة 20 دقيقة لازدراء الجل. انقعها في ماء خال من النوكلياز طوال الليل. ثم قم بتحليله للتحقق من جودة CNA.

استخدم مقياس الطيف الضوئي لتحديد تركيز CNA وتخزين العينات عند 80 درجة مئوية تحت الصفر لإجراء الحقن الدقيق للحمض النووي الريبي. استخدم وسط ND 96 لملء طبق بتري مكشط بعد ساعة إلى ساعتين من تساقط الأوراق. رتب الصودات على طول ممر مكشط في الطبق.

بعد ذلك ، باستخدام ماصة صغيرة شعرية ذات طرف مكسور بزاوية 45 درجة. أدخل الطرف الشعري بعمق حوالي 150 إلى 200 ميكرون في المنطقة الاستوائية أسفل منطقة المصطبغ. حقن 30 نانوغراما من CRNA في 60 نانولترا في البويضة الأولى.

ثم انتظر من خمس إلى 10 ثوان قبل إزالة الطرف الشعري لمنع العينة من التسرب. لحقن الخلية التالية حرك الطبق يدويا. انقل الخلايا المحقونة إلى 24 لوحة ثقافة بئر مملوءة بثلاثة ملليلتر من وسط ND 96 وقم بتوجيهها عند 19 درجة مئوية لتحفيز النضج الانقسامي.

احتضان البويضات في ND 96 بميكروغرامين لكل مليلتر من هرمون البروجسترون أو PG عند 19 درجة مئوية لمدة 15 ساعة. اختبر تأثير الترجمة للنوع البري EIF 4G واحد CRNAs على النمط الظاهري المتحور وفقا لبروتوكول النص. لتحديد مدى انهيار الحويصلة الجرثومية تحت مجهر ستيريو.

احسب عدد الخلايا الناضجة بعد تحفيز PG من خلال وجود بقعة بيضاء في عمود الأسود. كرر العد كل ساعة حتى الساعة 24 لإجراء تحليل الدم الغربي. استخدم حركات ذهابا وإيابا لطرف ماصة صغيرة عند أربع درجات مئوية لتجانس 10 صويتات في 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت الموضح هنا.

الطرد المركزي للعينات عند 10 ، 000 مرة G لمدة 15 دقيقة لاستخراج الجزء السيتوبلازمي في المنتصف. المرحلة من الجزء العلوي من الدهون المقابلة والجزء السفلي إلى الحطام الخلوي. اجمع الجزء السيتوبلازمي وقم بتخزين حصة لتحديد تركيز البروتين.

اجمع الباقي بنسبة واحد إلى واحد مع المخزن المؤقت لعينة lamely أو Biss قبل تشغيل صفحة SDS والنشاف الغربي. وفقا لبروتوكول النص. لإجراء فحص تهوية بولي ، ضع خمسة صويت لكل حالة في أنابيب فوج دقيقة سعة 1.5 مليلتر مع مليلتر واحد من النوكلياز الخالي من XPBS يغسل الصيولات.

ثم تحت غطاء الدخان ، استخدم مجموعة استخراج الحمض النووي الريبي وفقا لتعليمات الشركة المصنعة لعزل الحمض النووي الريبي. بعد التحقق من سلامة الحمض النووي الريبي وتحديد التركيز ، قم بإعداد مخاليطين للربط لكل حالة CRNA مع الكواشف التالية للخليط الأول. أضف الحمض النووي الريبي من الخلايا غير المحفزة ب pg وإلى الخليط الثاني.

أضف الحمض النووي الريبي من البويضات المحفزة PG. احتضن عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة ، ثم عند 65 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. لتعطيل الإنزيم باستخدام مجموعة النسخ العكسي CD NA.

لكل عينة ، قم بإعداد خليط RT المدرج هنا. أضف 10 ميكرولتر من تفاعل الربط المعد مسبقا وقم بإجراء RT وفقا لتعليمات الشركة المصنعة بعد إجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل ، باستخدام خليط التفاعل التالي والظروف لكل تفاعل عند أربعة ميكرولتر من المخزن المؤقت للتحميل وقم بتشغيل 10 ميكرولتر من كل عينة على 3٪ agros gel عند 110 مسامير. أخيرا ، قم بتحليل الجل بعد 10 و 20 دقيقة لملاحظة تغيير في الحجم يعكس طول ذيل polyA وبالتالي نضوج الحمض النووي الريبي ، وهو شرط أساسي لترجمتها.

كما هو موضح هنا ، فإن النضج الحركي للبويضات الدقيقة التي يتم حقنها في ظل ظروف التحكم يشبه النوع البري مع أعداد مماثلة تخضع ل GVBD في 12 و 24 ساعة بعد تحفيز PG ، بعد 24 ساعة من تحفيز PG. النسبة المئوية للبويضات التي تصل إلى مرحلة النضج متشابهة بالنسبة للنوع البري وكذلك الماء وعناصر التحكم المحقونة GFP مما يشير إلى أن الحقن الدقيق بالماء أو التحكم أو EIF 4G one CRNAs كان له تأثير ضئيل على الحقن المجهري لعضل البويضات مع EIF 4G السلبي السائد ، ومع ذلك ، أدى إلى انخفاض كبير في GVBD حتى بعد تحفيز PG. يوضح هذا الشكل أنه يمكن استعادة عيب النضج من النوع البري CRNA حيث تزداد نسبة النوع البري إلى EIF 4G السلبية السائدة CRNA واحد.

وكذلك النسبة المئوية للخلايا التي تخضع للنضج كما هو متوقع. لم يتم الكشف عن أي تعبير عن الطحالب الذاتية في غياب تحفيز PG والإفراط في التعبير عن EIF 4G ، والتأثير السلبي السائد على الطحالب الداخلية بالاتفاق مع النتائج السابقة. بالإضافة إلى ذلك ، لا يظهر Aurora AEEG two ، الذي يعمل في المنبع من تحريض الطحالب ، أي دليل على عدم تنظيم البروتين أو شكله الفسفوري الناجم عن تحفيز PG.

على العكس من ذلك ، يتم تثبيط الفسفرة ثنائية ، التي يسببها الطحالب ، في وجود EIF 4G السلبية المهيمنة. بمجرد إتقان ، يمكن إجراء هذه التقنية في غضون خمسة أيام إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر ألا تتجاوز 120 نانولترا من CNA بتركيز أقل من نانوجرام معين باتباع هذا الإجراء.

على الرغم من أنه يمكن إجراء طريقة مثل تحليل التنميط متعدد الأشكال من أجل الإجابة على سؤال إضافي مثل تحديد الحمض النووي الريبي الذي قد يكون مترجما بشكل سيئ أو عالي الترجمة.