فيفو السابقين الثقافة من بلعومي الأقواس لدراسة القلب والعضلات الأسلاف ومكانها المناسب

الهدف العام من هذا الإجراء هو دراسة صيانة وهجرة ومصير أسلاف القلب والعضلات في الأديم المتوسط البلعومي. يتم تحقيق ذلك عن طريق تشريح الأقواس البلعومية أولا من جنين الفأر الذي تم حصاده حديثا. بعد ذلك ، يتم وضع الأقواس في فيلم من الوسائط لتسهيل ارتباطها.

تتم مراقبة الخلايا الموجودة داخل أو المهاجرة من البلعوم يوميا. في النهاية ، يمكن استخدام تتبع النسب الفلوري القائم على Cree لتتبع تمايز الهجرة وتجديد أسلاف القلب والعضلات داخل أقواس البلعوم. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها نظام خارج الجسم الحي الوحيد لدراسة مجموعة متجددة من أسلاف القلب أو العضلات وبيئتهم المكروية في المختبر.

يعد عرض هذه الطريقة أمرا بالغ الأهمية لأن الأقواس الأبوية في أجنة الفئران البالغة من العمر 9.5 يوما يتراوح حجمها بين اثنين و 300 ميكرومتر فقط ، مما يجعل من الصعب جدا التعرف عليها وتشريحها دون تصور مسبق. قبل البدء في الإجراء. كودا 12 ، صفيحة بئر مع PBS مكملة بنسبة 10٪ FBS.

بعد ساعة واحدة ، استبدل محلول الطلاء ب 200 ميكرولتر من الوسط الخالي من المصل لكل بئر. قم بتدوير اللوحة للتأكد من أن طبقة متوسطة تغطي كامل سطح قيعان البئر. بعد ذلك ، قم برش وتنظيف بطن الفأر الحامل القتل الرحيم بنسبة 70٪ من الإيثانول.

ثم باستخدام أدوات معقمة ، قم بعمل شق 0.5 سم في المنطقة البحرية. أمسك الجلد أعلى وأسفل الشق واسحب برفق في اتجاهين متعاكسين. ثم قم بعمل شق على شكل حرف V في الغشاء من السرة إلى المبايض على كل جانب من البطن للكشف عن الرحم.

اقرص قناة البيض التي تربط الرحم بالمبيض بالملقط وقناة البيض على جانب المبيض بمقص لتحرير الرحم من المبيض. سحب الرحم برفق بواسطة uct. قطع الرحم من منطقة المثانة.

ثم اسحب الرحم لأعلى بواسطة UCT وقطع UCT على الجانب الآخر ، وتحرير الرحم من تجويف البطن. انقل الرحم إلى أنبوب سعة 50 مليلتر يحتوي على 20 مل من PBS البارد والمعقم مع الكالسيوم والمغنيسيوم. رج الأنبوب برفق لمدة 10 ثوان لغسل الدم.

ثم استخدم الملقط لنقل الرحم إلى طبق سعة 10 مليلتر وإضافة خمسة ملليلتر من PBS البارد إلى الأنسجة. بعد ذلك ، تحت المجهر المجسم ، استخدم زوجين من الملقط لفتح الرحم برفق وتشريح الأكياس السلوية التي تحتوي على الأجنة واحدة تلو الأخرى. ثم لكل جنين على حدة ، قم بقرص الكيس الأمنيوسي وإزالته برفق باستخدام زوج واحد من الملقط باستخدام الزوج الآخر لقطع الكيس وتحريره من الجنين.

ضع الجنين على جانبه واستخدم الملقط لقطع القوس الأول والثاني للخلف إلى القلب بين القوس والكيس البلعومي. بعد قلب الجنين وقطع القوس على الجانب الآخر هو توضيح فقط. قطع مجرى التدفق القلبي الذي يربط الأقواس بالجنين وإزالتها.

اضغط على كل من القوسين البلعومي وحررهما من مسار تدفق القلب المتبقي والأديم الباطن للأمعاء الأربعة. في المقابل ، قم بنقل الأنسجة إلى وسط الآبار الفردية للوحة المغلفة 12 البئر مع الحرص على عدم تغطية الأقواس بالوسط. لتسهيل التعلق ، احتضان الأقواس في ظل ظروف زراعة الخلايا.

بعد ساعتين ، أضف 200 ميكرولتر من 37 درجة مئوية ، وسط خال من المصل أسفل جوانب الآبار ، مع الحرص على بقاء الأقواس متصلة واحتضان الأنسجة طوال الليل. أكد في اليوم التالي بصريا أن الأقواس لا تزال متصلة. ثم أضف برفق 200 ميكرولتر إضافي من الوسط الخالي من المصل 37 درجة مئوية إلى الآبار.

إذا أصبحت الأنسجة غير متصلة وبدأت في الطفو ، فقم بإزالة الوسط برفق باستخدام ماصة دون إزالة الأقواس حتى يتبقى فيلم من الوسائط فقط. ثم استخدم طرف الماصة لتحريك الأقواس مرة أخرى إلى منتصف البئر واحتضان الأنسجة مرة أخرى. كل يومين ، استبدل أي وسط مبخر ب 100 إلى 200 ميكرولتر من الطازجة والمتوسطة أثناء النمو.

يمكن تتبع أسلاف عضلات الوجه والقلب أثناء تكاثرها وتهاجر من قوس البلعوم الأول والثاني لتصبح عضلة الرأس والقلب على التوالي. توفر زراعة الأقواس البلعومية طريقة فريدة لدراسة نمو القلب والعضلات بالتفصيل خارج الجسم الحي. باستخدام نظام قفل CRE ، يمكن تتبع ذرية الأديم المتوسط للفأر بواسطة مراسلي الفلورسنت عند تعبير Cree في غضون 24 إلى 48 ساعة من ثقافة خارج الجسم الحي في 36 إلى 72 ساعة.

يمكن تأكيد تكوين خلايا عضلة القلب بصريا عن طريق التعاقد التلقائي على مجموعات الخلايا المهاجرة داخل القوس الثاني ، وكذلك عن طريق تحليل علامات خلايا عضلة القلب المحددة. بعد ثلاثة إلى سبعة أيام من الثقافة ، يمكن تصور تكوين الأنبوب العضلي وعضلات الوجه على أنها خلايا ممدودة ومرتعشة تلقائيا داخل القوس الأول ، ومن خلال تحليل علامات عضلية محددة بعد تطورها. مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال بيولوجيا الخلايا الجذعية للقلب والعضلات لمراقبة ودراسة أسلاف التوسع ومنافذها بشكل مباشر في المختبر.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تشريح الأقواس الثقبية من أجنة الفئران النامية والثقافة في المختبر ، مما يسمح بدراسة التطور التوليدي للقلب والعضلات ، خارج الجسم الحي.