دقيقة والفينول الحرة الحمض النووي مبالغات من يوم 30 خنزيري الأجنة بواسطة PCR

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحديد جنس أجنة الخنازير في اليوم 30 بدقة ، باستخدام الحمض النووي الخالي من الفينول الذي تم الحصول عليه من كل جنين. وزوجان من الاشعال الخاصة بالجنس لتفاعل تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). هذه الطريقة لديها القدرة على الإجابة على أسئلة مختلفة تتعلق بفسيولوجيا التناسل في الثروة الحيوانية ، مثل تأثير عوامل الأم على نسبة الجنس بما في ذلك سعة الرحم وحالة التمثيل الغذائي للبذر بالإضافة إلى عوامل الأب المختلفة.

تتضمن ميزة هذه التقنية أي مواد كيميائية سامة مثل الفينول كلوروفورم ، أو أعمدة باهظة الثمن أثناء تنقية الحمض النووي. لذا ، دعنا نبدأ العرض على الطريق. العرض المرئي لهذه الطريقة لا يقل أهمية عن إعداد الأعراض.

من السهل تعلم الخطوات ولكن من المهم إيلاء عناية خاصة بالتفاصيل لتجنب التلوث المتبادل للأعراض. نقل عينات الأجنة إلى ثمانين درجة مئوية سالبة ، وفقا للنص. قم بتسمية أنابيب العينة بمعرف العينة المطلوب لعدد العينات المراد تحليلها.

استخدم الثلج الجاف لملء نصف وعاء حراري وأدخل أنبوب عينة مغطى مسبقا في الثلج الجاف. أثناء ارتداء القفازات الشتوية ، مع وجود زوج من قفازات الفحص في الأعلى ، انقل قذائف الهاون والمدقات المبردة مسبقا من الفريزر سالب ثمانين درجة مئوية إلى وعاء ثلج جاف. بعد ذلك ، ضع جنينا مجمدا داخل الهاون على الجليد الجاف ، ثم اسكب كمية كافية من النيتروجين السائل لتغطية الجنين.

واستخدم مدقة لطحنها إلى مسحوق ناعم. باستخدام ملعقة دقيقة ، انقل مسحوق الجنين إلى أنبوب عينة مغطى مسبقا ، وضع الأنبوب في الفريزر سالب ثمانين درجة. كرر طحن وتجميد كل جنين إضافي ، وتغيير قفازات الفحص بين العينات لتجنب التلوث المتبادل.

بعد وضع العلامات على جميع أنابيب الطرد المركزي الدقيقة اللازمة لعدد العينات المراد تحليلها ، انقل أنابيب العينة التي تحتوي على مسحوق الجنين من الفريزر سالب ثمانين درجة مئوية إلى وعاء من الثلج الجاف. ماصة 180 ميكرولتر من هيدروكسيد الصوديوم 50 ملليمولار في كل أنبوب طرد مركزي دقيق مسبقا. سخني الحاضنة إلى خمس وتسعين درجة مئوية.

باستخدام عود أسنان ، انقل ما يقرب من خمسة إلى عشرة ملليغرامات من مسحوق الجنين من أنبوب عينة إلى أنبوب مسمى مسبقا من هيدروكسيد الصوديوم. ارفع عود الأسنان ببطء من المحلول لتصور محللة الحمض النووي كمادة بيضاء لزجة تشبه الشفافية. انقل العينات التي تحتوي على محللة الحمض النووي إلى حاضنة خمس وتسعين درجة مئوية لمدة خمس دقائق ، ثم انقل الأنبوب على الفور إلى حاوية معزولة مملوءة بالثلج.

بعد ذلك ، أضف عشرين ميكرولترا من تريس هيدروكلوريد مولار واحد مباشرة في الأنابيب ، واضغط على الأنابيب للخلط برفق. باستخدام ورق الأس الهيدروجيني ، تأكد من أن الرقم الهيدروجيني يبلغ حوالي 8.0. بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي للأنابيب عند ألفي G ، ودرجة حرارة الغرفة لمدة دقيقتين لإزالة بقايا الأنسجة غير المذابة.

انقل 150 ميكرولترا من المادة الطافية الصافية العلوية إلى أنابيب جديدة. أو طبق 96 بئر. ويخزن في درجة حرارة أربع درجات مئوية لمدة تصل إلى أسبوعين.

أو سالب عشرين درجة مئوية لمدة تصل إلى عام واحد. يعتمد نجاح هذا البروتوكول على مدى دقة تصميم التمهيدي الخاص بك على كروموسوم X و Y. إذن كيف تتأكد من أنها على كروموسوم X و Y؟

يعد استخدام NCBI Map Viewer أفضل طريقة لإظهار ذلك. لتصميم بادئات خاصة بالجنس ل PCR ، استخدم موقع NCBI للحصول على أرقام الانضمام لمنطقة تحديد جنس علامة المسام Y.Or SRY وبروتين إصبع الزنك X-linked ، أو ZFX. انسخ والصق أرقام الانضمام إلى أداة تصميم التمهيدي عبر الإنترنت.

استخدم انفجار النيوكليوتيدات أو الانفجار N للتحقق من صحة خصوصية البادئات مقابل قاعدة البيانات الجينومية الحالية لعلامة المسام 104. لإدخال التسلسلات ، توجد فقط على كروموسوم X و Y ل SRY و ZFX ، على التوالي. لإجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل مع محللات الحمض النووي ، استخدم أي إنزيم تفاعل البوليميراز المتسلسل الجاهز للبدء الساخن ، وقم بإعداد مزيج رئيسي عن طريق إضافة اثنين من الاشعال الخاصة بالجنس بتركيز نهائي يبلغ 0.3 ميكرومولار في تفاعل تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل 15 ميكرولترا.

لأول مرة ، قم بتشغيل التفاعلات ، قم بإعداد أنبوب PCR واحد للتحكم السلبي بدون قالب ، وأنبوبين إضافيين للضوابط الإيجابية عن طريق إضافة ميكرولتر واحد من الحمض النووي الجيني لعلامة المسام الجنسية التي تم الحصول عليها تجاريا. بالنسبة للجولات اللاحقة من تفاعل البوليميراز المتسلسل ، قم بتضمين ميكرولتر واحد من عينة من آخر تحليل جنسي ناجح كعنصر تحكم إيجابي. قم بإعداد برنامج PCR التالي في جهاز تدوير حراري وقم بإجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR).

لتنويع العينات بعد تفاعل البوليميراز المتسلسل ، قم بإعداد جل الاغاروز 2٪ TBE مع صبغة هلام الحمض النووي السيبراني أو بروميد الإيثيديوم. أضف 1.5 ميكرولتر من صبغة التحميل 10X إلى العينات قبل تحميلها على الجل وتشغيله. راقب واضبط شدة الشريط تحت ضوء الفلورسنت والتقط صورة للجل.

تحديد الأجنة ذات الفرقة الواحدة على أنها أنثى وشريطين كذكر. تظهر هنا نتيجة تمثيلية لتحديد الجنس من 345 محللة للحمض النووي تم فحصها بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). درجة حرارة التلدين المثلى للبرايمر البالغة 65 درجة مئوية أعلى بشكل مرئي من TM للبادئات الموضحة هنا لتوليد كثافة مماثلة وأحجام أمبيلكون متوقعة.

يتم تقديم منتجين مضخمين من SRY و ZFX هنا. تنتج عينة المحللة من الأجنة الأنثوية نطاقا واحدا فقط من 506 زوجا من جزء الحمض النووي من جين ZFX الموجود على الكروموسوم X. تنتج جميع الأجنة الذكورية جزأين من الحمض النووي بكثافة متساوية تبلغ 400 زوج أساسي ل SRY و 506 زوجا أساسيا ل ZFX.

كما هو موضح هنا ، لم تظهر محللات الحمض النووي أي تثبيط لتفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل بعد فحص 345 جنينا. لم يتم جنس ثلاثة أفراد فقط وكانت النسبة المئوية للأجنة الأنثوية أعلى قليلا من الذكور. بمجرد إتقان هذه التقنية من الطحن إلى إجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل ، تستغرق معالجة حوالي عشرة أجنة حوالي ساعة.

عند القيام بهذه التقنية ، من المهم تجنب التلوث المتبادل ، خاصة عند نقل مسحوق الجنين إلى الأنابيب. باتباع هذا الإجراء ، يمكننا استخدام طرق أخرى مثل مثيلة الحمض النووي ، والمصفوفة الدقيقة ، والتسلسل للتحقيق في التأثيرات الجينومية والجينية للتغذية والأمراض المعدية بين الجنسين. سيمهد تطوير هذه التقنية الطريق للباحثين في مجالات علم وظائف الأعضاء التناسلية وعلوم لإجراء البحوث المتعلقة بإزدواج الشكل الجنسي في أنواع الثروة الحيوانية المختلفة.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تصميم بادئات خاصة بالجنس ، وتجريد الحمض النووي من الأجنة وإجراء تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام محللات الحمض النووي. تذكر أن العمل مع الثلج الجاف أمر خطير للغاية ، لذا اتخذ الاحتياطات المناسبة وارتداء القفازات والنظارات الواقية.