جيل وثقافة الدم ثمرة غشائي خلايا من الدم المحيطي الإنسان

الهدف العام من هذا البروتوكول هو توليد الخلايا البطانية لنمو الدم بشكل موثوق من الدم المحيطي البشري. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال بيولوجيا الأوعية الدموية ، مثل كيف يساهم خلل الخلايا البطانية في أمراض القلب والأوعية الدموية بما في ذلك ارتفاع ضغط الدم الشرياني الرئوي أو مرض فون ويلبراند. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تولد باستمرار مجموعة مستقرة من الخلايا البطانية لنمو الدم من حجم صغير من الدم المحيطي للبالغين سيكون الإجراء التوضيحي هو كريستوفر وانغ ، طالب الدراسات العليا من مختبري ومختبري البروفيسور نيكولاس موريل.

لبدء هذا الإجراء. لكل متبرع ، أضف ثلاثة ملليلتر من سترات الصوديوم إلى كل من أنبوبي الطرد المركزي المخروطي سعة 50 ملليلترا. ثم أضف 30 مل من الدم الذي تم جمعه إلى كل أنبوب.

اقلب الأنابيب برفق مرتين إلى ثلاث مرات للخلط. بعد ذلك ، قم بتخفيف 60 مل من الدم باستخدام DPBS بنسبة واحد إلى واحد قم بإمالة الأنبوب الذي يحتوي على تدرج الكثافة. وسيط الطرد المركزي بزاوية 20 درجة مع سطح العمل باستخدام ماصة مساعدة وماصة مصلية سعة 25 ملليلترا.

ضع ببطء 21 مل من الدم المخفف فوق الوسط. بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي للعينات عند 400 مرة جم لمدة 35 دقيقة في درجة حرارة الغرفة باستخدام المسرع والانقطاع أثناء الطرد المركزي إصلاح محلول الكولاجين بمعدل 50 ميكروغرام لكل مليلتر عن طريق تخفيف المخزون. اكتب الكولاجين الأول في 10 ملليلتر من 0.02 مولار حمض الخليك المعقم.

قم بتصفية معلق الكولاجين قبل الاستخدام. بعد ذلك ، أضف 7.5 مل من محلول الكولاجين إلى قارورة ثقافة الخلايا T 75. اترك القارورة مغطاة لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة.

بعد ساعة واحدة من الطلاء ، قم بشفط محلول الكولاجين وماصة 10 مل من DPBS في القارورة لغسل حمض الخليك المتبقي. استنشق DPBS وكرر الغسيل مرة أخرى. ثم أضف خمسة ملليلتر من وسط توليد BOEC إلى القارورة لمنع طلاء الكولاجين من الجفاف حتى يصبح معلق الخلية جاهزا للطلاء.

بعد الطرد المركزي المتدرج للكثافة ، اجمع بعناية طبقة الطبقة المصفاة باستخدام ماصة نقل بلاستيكية معقمة وتجنب نقل وسط تدرج الكثافة. يجب أن ينتج عن جمع المعطف المصقول ما يقرب من 20 مل من تعليق سيل والبلازما من كل أنبوب. بعد ذلك ، قم بتخفيف تعليق الخلية أحادية النواة في DPBS بنسبة واحد إلى واحد وقلبها للخلط ثم الطرد المركزي في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة عند 300 مرة G مع ضبط الفرامل والمسرع على الحد الأقصى بعد الطرد المركزي ، وشفط المادة الطافية وإعادة تعليق الخلايا عن طريق إضافة مليلتر واحد من وسيط توليد BOEC إلى كل حبيبات وسحب الماصة لأعلى ولأسفل بشكل متكرر ، واسحب جميع معلقات الخلية معا وقم بتعبئة الحجم الكلي إلى 10 ملليلتر مع الوسط المتبقي.

للحصول على تقدير لإجمالي عدد الخلية ، قم بتخفيف 10 ميكرولتر من معلق الخلية مع 490 ميكرولتر من محلول الترك لتكوين خلايا الدم الحمراء. ثم عد عينة سعة 10 ميكرولتر من معلق الخلية المخفف باستخدام مقياس الخلوي الدموي. بعد ذلك ، قم بوضع تعليق الخلية في قارورة T 75 مطلية بالكولاجين.

أعلى الحجم المتوسط حتى 15 مل لكل قارورة وثقافة. الخلايا عند 37 درجة مئوية في جو مرطب يحتوي على 5٪ CO2. الآن قم بتغيير الوسيط كل يومين عن طريق إضافة 15 مل من توليد BOEC الطازج ، وهو متوسط للثقافة في عطلات نهاية الأسبوع ، ويمكن تأخير التغييرات المتوسطة إلى كل ثلاثة أيام.

راقب قارورة ثقافة BOEC في اليوم السابع إلى 14 لظهور مستعمرات النتوء. حدد المستعمرات كمجموعات دائرية من الخلايا التي تظهر مورفولوجيا الحصى البطانية الكلاسيكية. بمجرد تحديد مستعمرة أو مستعمرات متعددة في القارورة ، استمر في التغييرات المتوسطة واسمح للمستعمرات بالنمو إلى ما يقرب من 1000 إلى 2000 خلية لكل مستعمرة.

قبل التعبئة ، حدد عدد الخلية لكل مستعمرة من خلال تقدير بصري تقريبي. ثم قم بتمرير الخلايا عن طريق شطف القوارير مرتين باستخدام 10 ملليلتر من DPBS. أضف خمسة ملليلتر من واحد × تريبسين في EDTA واحتضنه في حاضنة 37 درجة مئوية لمدة خمس دقائق.

بعد خمس دقائق ، قم بتحييد التربسين ب 10 ملليلتر من الوسط الذي يحتوي على FBS وقم بتعليق الخلايا مع سحب العينة المتكرر. بعد ذلك ، قم بعمل الطرد المركزي للتعليق عند 300 مرة G لمدة خمس دقائق. أعد تعليق الخلايا في 15 مل من توليد BOEC الطازج ، متوسط ، وقم بطلاء معلق الخلية بالكامل في قارورة T 75 جديدة بدون طلاء الكولاجين. استمر.

يتغير الوسط حتى تتلاقى الخلايا وتمر. الخلايا كما هو موضح سابقا للوحة التعبئة والتغليف المستمرة. ما لا يقل عن 750،000 خلية لكل قارورة T 75 حيث يمكن أن تتسبب كثافة الخلايا المنخفضة في توقف BO eecs عن التكاثر.

في هذا الإجراء ، يراقب التربسين الخلايا ويقوم بالطرد المركزي لها عند 300 مرة G لمدة خمس دقائق. بعد ذلك ، قم بسحب snat وإعادة تعليق الخلايا في 10 ملليلتر من المتوسط. اجمع عينة سعة 10 ميكرولتر من تعليق الخلية وقم بإجراء عد الخلايا يدويا.

بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي للعينة مرة أخرى وإعادة تعليقها في وسط حفظ التبريد المثلج البارد عند ضعفين 10 إلى ست خلايا لكل مليلتر. أضف 0.5 مل من تعليق الخلية إلى كل قارورة وضع القوارير في وعاء حفظ الأيزوبروبانول المثلج البارد. ثم ضع الوعاء في فريزر سالب 80 درجة مئوية لمدة ساعتين على الأقل قبل نقله إلى النيتروجين السائل.

لإذابة الخلايا ، أضف 10 مل من وسط التسخين إلى أنبوب طرد مركزي مخروطي الشكل سعة 15 مل. قم بإزالة الخلايا من النيتروجين السائل وقم بإذابة الثلج في حمام مائي 37 درجة مئوية مع تحريك لطيف حتى يتبقى بلورة ثلجية صغيرة فقط في القارورة. ثم أضف محتويات القارورة بالتنقيط إلى أنبوب الطرد المركزي المخروطي وقم بالدوران عند 300 مرة G لمدة خمس دقائق.

بعد ذلك ، استنشق المادة الطافية وتعليق الحبيبات الخلية. أضف تعليق الخلية إلى قارورة T 75 وقم بتعبئة المتوسط إلى 15 ملليلترا. في هذه الصورة ، يتم ترتيب مستعمرات النمو ، التي تظهر كمجموعات من الخلايا الشبيهة بالبطانة في طبقة أحادية مرصوفة بالحصى وتتكاثر شعاعيا من نقطة مركزية تحيط بمستعمرات النمو هي الخلايا أحادية الخلية الملتصقة التي تشكل الغالبية العظمى من الخلايا في الثقافات المبكرة بعد التعبئة ، تتولى بو Oecs شديدة التكاثر المزرعة حيث تموت الخلايا أحادية الخلية غير التكاثرية أو تفشل في إعادة التوصيل.

فيما يلي صورة تمثيلية للتألق المناعي لمناعة Bo Oecs ملطخة بجسم مضاد ضد علامة سطح الخلية البطانية CD 1 44. وفي هذه الصورة كانت B oecs عبارة عن صبغة مناعية مع جسم مضاد ضد عامل البروتين السكري في الدم فون ويلبراند. بمجرد إتقان ، يمكن إجراء هذه التقنية في أقل من ساعتين إذا تم إجراؤها بشكل صحيح.

أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر معالجة عينات الدم في أسرع وقت ممكن ويفضل أن يكون ذلك في غضون ساعتين من جمعها. باتباع هذا الإجراء ، يمكن استخدام الخلايا لدراسة وظيفة الخلايا البطانية في الصحة والمرض أو إعادة برمجتها في خلايا جذعية قوية مستحثة لاستخدامها في دراسات التمايز أو نمذجة المرض أو العلاج الخلوي بعد تطورها. مهدت هذه التقنية الطريق لنا لدراسة تأثير الطفرات في مستقبلات البروتين المورفوجيني للعظام من النوع الثاني على التسبب في ارتفاع ضغط الدم الشرياني الرئوي في كل من الخلايا البطانية لنمو دم المريض وخلايا العضلات المزاجية IPSC.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية توليد وتوصيف الخلايا البطانية المستقرة لنمو الدم من حجم صغير من الدم المحيطي. لا تنس أن العمل بدم بشري غير محجوز يمكن أن يكون خطيرا للغاية ويجب دائما ارتداء معدات الحماية الشخصية ، بما في ذلك القفازات ومعطف المختبر أثناء تنفيذ هذا الإجراء.