استخدام الأرنب عيون في دراسات حركية الدواء من داخل بصري المخدرات

الهدف العام من هذه التجربة هو التحقيق في خصائص الحرائك الدوائية للأدوية داخل العين باستخدام عيون الأرانب. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال علم الأدوية للعين ، مثل الحرائك الدوائية للأدوية المحقونة داخل الجسم الزجاجي. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أن مقل عيون الأرانب كبيرة نسبيا ، وبالتالي يمكن مقارنة تقنيات الحقن داخل الجسم الزجاجي وتوزيع العقاقير المحقونة داخل العين بالبشر.

بالإضافة إلى ذلك ، فإن الأرانب أسهل في التعامل معها وأقل تكلفة من الرئيسيات. تقف الآثار المترتبة على هذه التقنية على توصيل الدواء داخل العين ، لأن استخدام توصيل الدواء يؤثر بشكل كبير على تركيز الدواء ومدة العمل في حجرة العين. وبالتالي ، يجب فحص تركيزات الدواء بمرور الوقت في كل حجرة.

سيوضح الإجراء هاي كيونغ هونغ ، وهو باحث ما بعد الدكتوراه من مختبري. بعد تخدير أرنب أبيض نيوزيلندي سليم ، وفقا لبروتوكول النص ، ضع قطرة مخدر موضعية ، ثم ضع مرهما أو جل مبلل على القرنية لمنع جفاف العين حتى التعافي من التخدير. لتوسيع التلميذ ، ضع قطرة أو قطرتين من فينيل إيفرين هيدروكلوريد ، وشبه منحرف.

استخدم قطعة قطن لتطبيق 10 في المائة من بوفيدون اليود على الجلد المحيط بالعين. ثم ضع قطرة واحدة من خمسة في المائة من بوفيدون اليود على ملتحمة العين. بعد ذلك ، باستخدام إبرة قياس 30 متصلة بحقنة ، قم بحقن الدواء المعني داخل الجسم الزجاجي ، ملليمتر واحد خلف الطرف الجراحي في الربع فوق الصدغي ، بشكل عمودي على سطح الصلبة.

تقليل التسرب من الصلبة ، حيث يمكن أن يكون التسرب مصدرا للتحيز. لمنع التسرب من التجويف الزجاجي ، يجب وضع طرف قطني بعد إزالة الإبرة ، ويجب تطبيق الضغط لمدة 30 ثانية على الأقل. بعد إتاحة الوقت الكافي للتئام الجروح ، راقب الأرانب المعالجة يوميا لمدة أسبوع ، ومرة واحدة في الأسبوع بعد ذلك بحثا عن أي علامة على التهاب شديد داخل العين.

بعد القتل الرحيم للأرانب وفقا لبروتوكول النص ، استخدم ضام الجفن لفتح الشق الجفني. من ملليمترات إلى ثلاثة ملليمترات خلف الليمع ، قم بعمل شق ملتحمة بزاوية 360 درجة ويمتد للخلف عن طريق تشريح الملتحمة وكبسولة لسان من الكرة الأرضية. قطع العضلات خارج العين بالقرب من إدخالها في الكرة الأرضية.

ثم ، باستخدام ملقط منحني ، قم بتثبيت العصب البصري وقطع العصب بين الملقط والكرة الأرضية. قم بإزالة مقلة العين نفسها مع ترك الأنسجة المحيطة سليمة. ثم ، باستخدام النيتروجين السائل ، قم بتجميد مقل العيون على الفور وتخزينها عند 80 درجة مئوية.

بعد عزل مقل العيون وتجميدها لجميع النقاط الزمنية ، قبل إزالة الجليد ، افصل مقل العيون المجمدة بسرعة إلى ثلاث مقصورات. الجسم الزجاجي ، والفكاهة المائية ، والمشيمية شبكية العين. إن فصل مقلة العين المجمدة إلى ثلاث مقصورات ليس بالمهمة السهلة إذا تم إذابة مقلة العين.

الفصل السريع للمقصورات الثلاث مع الحفاظ على تجميد الأنسجة هو الخطوة الأساسية لنجاح التقسيم. بعد ذلك ، لفتح الكرة الأرضية ، استخدم شفرة مشرط لعمل شق في طيفي القرنية ، وشق وفصل الجزء الأمامي عن الجزء الخلفي ، ثم عزل الخلط المائي ، وهو الحيز المجمد أمام القزحية. باستخدام ملقط الأنسجة، اسحب القزحية والعدسة المجمدة واخفضها لإزالة الأنسجة.

ثم عندما يصبح الوصول إلى الجسم الزجاجي متاحا ، افصله عن الشبكية المتبقية والمشيمية والصلبة. الآن ، باستخدام شفرة مشرط رقم 15 ، افصل أنسجة المشيمة الشبكية عن الصلبة الأساسية. بالنسبة للمقايسات المناعية، قم بإذابة عينات الخلط المائي وقياس حجم كل عينة.

تحديد وزن العينات المجمدة عن طريق طرح وزن الأنبوب الفارغ من وزن الأنبوب الذي يحتوي على العينة المجمدة. بعد وزن العينات الزجاجية ، استخدم PBS مع واحد بالمائة BSA لإذابة الأنسجة وإذابتها. ثم ضعه على دوار عند أربع درجات مئوية طوال الليل.

ثم قم بالطرد المركزي للأنسجة عند 387 مرة جم لمدة 10 دقائق. لتجانس عينات المشيمة الشبكية بعد وزن الأنسجة المجمدة ، أضف كاشف استخراج البروتين بنسبة واحد إلى 10 من الأنسجة إلى الكاشف. ثم باستخدام مجانس دقيق للأنسجة المبردة مسبقا ، قم بتجانس الأنسجة.

قم بالطرد المركزي للعينة المحللة لمدة 10 دقائق عند 12 ، 000 إلى 20 ، 000 مرة G ، وانقل المادة الطافية إلى أنبوب EPP مبرد. لإجراء ELISA ، استخدم 0.1 في المائة BSA في XPBS واحد لتخفيف عينات الجسم الزجاجي والخلط المائي وعينات المشيمة إلى تركيزات تقع ضمن حد الكشف ، واستخدمها للمقايس. Aliquot 100 ميكرولتر لكل بئر من العينات والتركيزات المعروفة للدواء الذي يهم لوحة البئر 96 لبناء منحنى قياسي.

ثم احتضن الطبق طوال الليل عند أربع درجات مئوية ، قبل استخدام 200 ميكرولتر من محلول الغسيل لغسل الطبق ثلاث مرات. قم بتخفيف الجسم المضاد الثانوي واحد إلى 20،000 في PBS مع 0.1 في المائة BSA ، وأضف 100 ميكرولتر إلى كل بئر من لوحة الفحص. بعد حضانة اللوحة عند أربع درجات مئوية بين عشية وضحاها ، قم بقياس OD 450.

بعد إنشاء منحنى قياسي وحساب تركيزات الدواء في العينات وفقا لبروتوكول النص ، قم بتحليل بيانات تركيز الدواء باستخدام نماذج مجزأة باستخدام برنامج النمذجة مثل برنامج Phoenix Winnonlin. في النمذجة الكلاسيكية WNL5 ، انقر فوق نموذج PK ، وفي قائمة الإعداد ، قم بتعيين وقت المراقبة والجرعة المعطاة وتركيز الدواء. حدد نموذج المقصورة النهائي واحسب معلمات الحركية الصيدلية ذات الأهمية وفقا لبروتوكول النص.

بعد الحقن داخل الجسم الزجاجي لدواء محل اهتمام ، وتحضير عينات الأنسجة كما هو موضح في هذا الفيديو ، تم إجراء ELISA لتحديد تركيز الدواء في الجسم الزجاجي والخلط المائي والشبكية. كما هو موضح هنا ، ترتبط الكثافة البصرية للون بتركيز الدواء محل الاهتمام. يمكن تركيب بيانات التركيز التي يتم حسابها من المنحنى القياسي مع نموذج الحركية الصيدلية ، ويمكن تحديد معلمات الحركية المرضية من الخط المجهز.

في هذه التجربة ، تم تقييم ومقارنة الحركية الصيدلية للحقن داخل الجسم الزجاجي بيفاسيزوماب ، في الجسم الزجاجي ، والعيون غير الزجاجية لنقاط زمنية متعددة باستخدام المعادلة التالية. كما هو موضح هنا ، فإن التركيز المقدر وفقا للنموذج المناسب ، يتطابق جيدا مع القيم المقاسة الفعلية. لم تكن هناك فروق يعتد بها في تركيز الجسم الزجاجي أو عمر النصف لبيفاسيزوماب، مما يشير إلى أن دور الجسم الزجاجي في توزيع بيفاسيزوماب وإزالته ضئيل.

بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء تقنية فصل مقلة العين الحرجة في 10 دقائق إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر أن النقاط الزمنية للتضحية بالأرانب وتطعيم مقل عيونها يجب أن تكون فردية للدواء محل الاهتمام ، حيث يمكن أن تختلف معلمات الحرائك الدوائية مثل الوزن الجزيئي بشكل كبير. بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال علم الأدوية للعين لاستكشاف الحركية الدوائية داخل العين في عين الأرنب.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إجراء دراسة الحرائك الدوائية داخل العين باستخدام عيون الأرانب. لا تنس أنه يجب مراعاة الاختلافات بين عيون الأرانب والإنسان بعناية عند استقراء خصائص الحرائك الدوائية التي يتم الحصول عليها من الدراسات التي أجريت على على البشر.