Name: تقييم تكوين الخلايا العصبية الابتدائية في القيطم الأجنة عن طريق المناعية (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 47 s
Description: اكتشف طريقة سريعة لتصور الخلايا العصبية في أجنة Xenopus باستخدام التلطيخ المناعي. تتيح هذه التقنية رؤية تجمعات الخلايا الجذعية العصبية والخلايا العصبية المتمايزة في تجربة واحدة.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

نشكر البروفيسور مايكل Klymkowsky في جامعة كولورادو في بولدر والبروفيسور نانسي Papalopulu في جامعة مانشستر لتوفير يرجى مكافحة Sox3 ومكافحة Myt1 الأجسام المضادة، على التوالي. نشكر أعضاء المختبر Papalopulu للحصول على اقتراحات الثاقبة في تطوير هذا البروتوكول. وأيد هذا العمل من قبل اثنين من شفاء دراسية مؤسسة لSZ وJL، منحتين المشروع من مؤسسة شفاء لSZ / EA وJL / EA على التوالي، منحة برنامج واحد من ويلكوم ترست لEA (WT082450MA)، واحد منحة الدعم المؤسسي الاستراتيجية من ويلكوم ترست [097820 / Z / 11 / Z].

<ol><li>De Robertis, E. M., Kuroda, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dorsal-ventral+patterning+and+neural+induction+in+Xenopus+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Dorsal-ventral patterning and neural induction in Xenopus embryos.</a> Annual Rev Cell Dev Biol. 20, 285-308 (2004).</li>
<li>Wilson, S. W., Houart, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+steps+in+the+development+of+the+forebrain%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Early steps in the development of the forebrain.</a> Dev Cell. 6, 167-181 (2004).</li>
<li>Hemmati-Brivanlou, A., Melton, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vertebrate+embryonic+cells+will+become+nerve+cells+unless+told+otherwise%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Vertebrate embryonic cells will become nerve cells unless told otherwise.</a> Cell. 88, 13-17 (1997).</li>
<li>Hemmati-Brivanlou, A., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+activin+receptor+signaling+promotes+neuralization+in+Xenopus%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Inhibition of activin receptor signaling promotes neuralization in Xenopus.</a> Cell. 77, 273-281 (1994).</li>
<li>Fainsod, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dorsalizing+and+neural+inducing+gene+follistatin+is+an+antagonist+of+BMP-4%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Dev%22%5BJournal%5D)">The dorsalizing and neural inducing gene follistatin is an antagonist of BMP-4.</a> Mech Dev. 63, 39-50 (1997).</li>
<li>Piccolo, S., Sasai, Y., Lu, B., De Robertis, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dorsoventral+patterning+in+Xenopus%3A+inhibition+of+ventral+signals+by+direct+binding+of+chordin+to+BMP-4%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Dorsoventral patterning in Xenopus: inhibition of ventral signals by direct binding of chordin to BMP-4.</a> Cell. 86, 589-598 (1996).</li>
<li>Zimmerman, L. B., De Jesus-Escobar, J. M., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Spemann+organizer+signal+noggin+binds+and+inactivates+bone+morphogenetic+protein+4%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The Spemann organizer signal noggin binds and inactivates bone morphogenetic protein 4.</a> Cell. 86, 599-606 (1996).</li>
<li>Koyano, S., Ito, M., Takamatsu, N., Takiguchi, S., Shiba, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Xenopus+Sox3+gene+expressed+in+oocytes+of+early+stages%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">The Xenopus Sox3 gene expressed in oocytes of early stages.</a> Gene. 188, 101-107 (1997).</li>
<li>Rogers, C. D., Harafuji, N., Archer, T., Cunningham, D. D., Casey, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenopus+Sox3+activates+sox2+and+geminin+and+indirectly+represses+Xvent2+expression+to+induce+neural+progenitor+formation+at+the+expense+of+non-neural+ectodermal+derivatives%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Dev%22%5BJournal%5D)">Xenopus Sox3 activates sox2 and geminin and indirectly represses Xvent2 expression to induce neural progenitor formation at the expense of non-neural ectodermal derivatives.</a> Mech Dev. 126, 42-55 (2009).</li>
<li>Zhang, C., Basta, T., Jensen, E. D., Klymkowsky, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+beta-catenin%2FVegT-regulated+early+zygotic+gene+Xnr5+is+a+direct+target+of+SOX3+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The beta-catenin/VegT-regulated early zygotic gene Xnr5 is a direct target of SOX3 regulation.</a> Development. 130, 5609-5624 (2003).</li>
<li>Penzel, R., Oschwald, R., Chen, Y., Tacke, L., Grunz, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+and+early+embryonic+expression+of+a+neural+specific+transcription+factor+xSOX3+in+Xenopus+laevis%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Characterization and early embryonic expression of a neural specific transcription factor xSOX3 in Xenopus laevis.</a> Int J Dev Biol. 41, 667-677 (1997).</li>
<li>Bellefroid, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X-MyT1%2C+a+Xenopus+C2HC-type+zinc+finger+protein+with+a+regulatory+function+in+neuronal+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">X-MyT1, a Xenopus C2HC-type zinc finger protein with a regulatory function in neuronal differentiation.</a> Cell. 87, 1191-1202 (1996).</li>
<li>Moody, S. A., Miller, V., Spanos, A., Frankfurter, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+expression+of+a+neuron-specific+beta-tubulin+in+frog+%28Xenopus+laevis%29%3A+a+marker+for+growing+axons+during+the+embryonic+period%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Developmental expression of a neuron-specific beta-tubulin in frog (Xenopus laevis): a marker for growing axons during the embryonic period.</a> J Comp Neurol. 364, 219-230 (1996).</li>
<li>Oschwald, R., Richter, K., Grunz, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+a+nervous+system-specific+class+II+beta-tubulin+gene+in+Xenopus+laevis+embryos+by+whole-mount+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Localization of a nervous system-specific class II beta-tubulin gene in Xenopus laevis embryos by whole-mount in situ hybridization.</a> Int J Dev Biol. 35, 399-405 (1991).</li>
<li>Chitnis, A., Henrique, D., Lewis, J., Ish-Horowicz, D., Kintner, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+neurogenesis+in+Xenopus+embryos+regulated+by+a+homologue+of+the+Drosophila+neurogenic+gene+Delta%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Primary neurogenesis in Xenopus embryos regulated by a homologue of the Drosophila neurogenic gene Delta.</a> Nature. 375, 761-766 (1995).</li>
<li>Roberts, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+functional+organization+of+spinal+neurons+in+developing+lower+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res+Bull%22%5BJournal%5D)">Early functional organization of spinal neurons in developing lower vertebrates.</a> Brain Res Bull. 53, 585-593 (2000).</li>
<li>Hartenstein, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+neurogenesis+in+Xenopus%3A+the+spatio-temporal+pattern+of+proliferation+and+cell+lineages+in+the+embryonic+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Early neurogenesis in Xenopus: the spatio-temporal pattern of proliferation and cell lineages in the embryonic spinal cord.</a> Neuron. 3, 399-411 (1989).</li>
<li>Hirabayashi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Wnt%2Fbeta-catenin+pathway+directs+neuronal+differentiation+of+cortical+neural+precursor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The Wnt/beta-catenin pathway directs neuronal differentiation of cortical neural precursor cells.</a> Development. 131, 2791-2801 (2004).</li>
<li>Munji, R. N., Choe, Y., Li, G., Siegenthaler, J. A., Pleasure, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt+signaling+regulates+neuronal+differentiation+of+cortical+intermediate+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Wnt signaling regulates neuronal differentiation of cortical intermediate progenitors.</a> J Neurosci. 31, 1676-1687 (2011).</li>
<li>Bonev, B., Stanley, P., Papalopulu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA-9+Modulates+Hes1+ultradian+oscillations+by+forming+a+double-negative+feedback+loop%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">MicroRNA-9 Modulates Hes1 ultradian oscillations by forming a double-negative feedback loop.</a> Cell Rep. 2, 10-18 (2012).</li>
<li>Bonev, B., Pisco, A., Papalopulu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA-9+reveals+regional+diversity+of+neural+progenitors+along+the+anterior-posterior+axis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">MicroRNA-9 reveals regional diversity of neural progenitors along the anterior-posterior axis.</a> Dev Cell. 20, 19-32 (2011).</li>
<li>Munoz, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+of+Xenopus+laevis+spinal+cord+requires+Sox2%2F3+expressing+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Regeneration of Xenopus laevis spinal cord requires Sox2/3 expressing cells.</a> Dev Biol. , (2015).</li>
<li>Zhang, S., Li, J., Lea, R., Vleminckx, K., Amaya, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fezf2+promotes+neuronal+differentiation+through+localised+activation+of+Wnt%2Fbeta-catenin+signalling+during+forebrain+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Fezf2 promotes neuronal differentiation through localised activation of Wnt/beta-catenin signalling during forebrain development.</a> Development. 141, 4794-4805 (2014).</li>
<li>Zhang, S., Li, J., Lea, R., Amaya, E., Dorey, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Functional+Genome-Wide+In+Vivo+Screen+Identifies+New+Regulators+of+Signalling+Pathways+during+Early+Xenopus+Embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">A Functional Genome-Wide In Vivo Screen Identifies New Regulators of Signalling Pathways during Early Xenopus Embryogenesis.</a> PloS one. 8, e79469(2013).</li>
<li>Wang, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sox3+expression+identifies+neural+progenitors+in+persistent+neonatal+and+adult+mouse+forebrain+germinative+zones%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Sox3 expression identifies neural progenitors in persistent neonatal and adult mouse forebrain germinative zones.</a> J Comp Neurol. 497, 88-100 (2006).</li>
<li>Sabherwal, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+apicobasal+polarity+kinase+aPKC+functions+as+a+nuclear+determinant+and+regulates+cell+proliferation+and+fate+during+Xenopus+primary+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The apicobasal polarity kinase aPKC functions as a nuclear determinant and regulates cell proliferation and fate during Xenopus primary neurogenesis.</a> Development. 136, 2767-2777 (2009).</li>
<li>Falk, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation+of+cDNA%2FMorpholinos+to+targeted+areas+of+embryonic+CNS+in+Xenopus%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Electroporation of cDNA/Morpholinos to targeted areas of embryonic CNS in Xenopus.</a> BMC Dev Biol. 7, 107(2007).</li>
<li>Moreno, N., Retaux, S., Gonzalez, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatio-temporal+expression+of+Pax6+in+Xenopus+forebrain%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Spatio-temporal expression of Pax6 in Xenopus forebrain.</a> Brain Res. 1239, 92-99 (2008).</li>
<li>Kay, B. K., Shah, A. J., Halstead, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+the+Ca2%2B-binding+protein%2C+parvalbumin%2C+during+embryonic+development+of+the+frog%2C+Xenopus+laevis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Expression of the Ca2+-binding protein, parvalbumin, during embryonic development of the frog, Xenopus laevis.</a> J Cell Biol. 104, 841-847 (1987).</li>
<li>Park, B. Y., Hong, C. S., Weaver, J. R., Rosocha, E. M., Saint-Jeannet, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xaml1%2FRunx1+is+required+for+the+specification+of+Rohon-Beard+sensory+neurons+in+Xenopus%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Xaml1/Runx1 is required for the specification of Rohon-Beard sensory neurons in Xenopus.</a> Dev Biol. 362, 65-75 (2012).</li>
<li>Lea, R., Bonev, B., Dubaissi, E., Vize, P. D., Papalopulu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicolor+fluorescent+in+situ+mRNA+hybridization+%28FISH%29+on+whole+mounts+and+sections%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Multicolor fluorescent in situ mRNA hybridization (FISH) on whole mounts and sections.</a> Methods Mol Biol. 917, 431-444 (2012).</li>
<li>Canaria, C. A., Lansford, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+optical+imaging+in+living+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Advanced optical imaging in living embryos.</a> Cell Mol Life Sci. 67, 3489-3497 (2010).</li>
<li>Prouty, A. M., Wu, J., Lin, D. T., Camacho, P., Lechleiter, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiphoton+laser+scanning+microscopy+as+a+tool+for+Xenopus+oocyte+research%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Multiphoton laser scanning microscopy as a tool for Xenopus oocyte research.</a> Methods Mol Biol. 322, 87-101 (2006).</li>
<li>Love, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((pTransgenesis%3A+a+cross-species%2C+modular+transgenesis+resource%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">pTransgenesis: a cross-species, modular transgenesis resource.</a> Development. 138, 5451-5458 (2011).</li>
<li>Kovacevic Grujicic, N., Mojsin, M., Krstic, A., Stevanovic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+characterization+of+the+human+SOX3+promoter%3A+identification+of+transcription+factors+implicated+in+basal+promoter+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Functional characterization of the human SOX3 promoter: identification of transcription factors implicated in basal promoter activity.</a> Gene. 344, 287-297 (2005).</li>
<li>Wang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myt1+and+Ngn3+form+a+feed-forward+expression+loop+to+promote+endocrine+islet+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Myt1 and Ngn3 form a feed-forward expression loop to promote endocrine islet cell differentiation.</a> Dev Biol. 317, 531-540 (2008).</li>
<li>Rogers, C. D., Archer, T. C., Cunningham, D. D., Grammer, T. C., Casey, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sox3+expression+is+maintained+by+FGF+signaling+and+restricted+to+the+neural+plate+by+Vent+proteins+in+the+Xenopus+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Sox3 expression is maintained by FGF signaling and restricted to the neural plate by Vent proteins in the Xenopus embryo.</a> Dev Biol. , 307-319 (2008).</li>
</ol>

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

نحن هنا لشرح طريقة مريحة وفعالة لتصور الخلايا العصبية الأولية في أجنة القيطم. يسمح هذا الأسلوب تقييم أنواع مختلفة من الخلايا العصبية، بما في ذلك الخلايا الجذعية العصبية والخلايا العصبية الأولية متباينة باستخدام خلية علامات نوع محدد. بروتوكول قوي عموما مع مستوى عال جدا من التكاثر. للأجنة التي هي في مراحل الفقس مسبقا (أي ما يصل لمرحلة 28)، ونحن نوصي إزالة الغشاء المحي قبل تثبيت يدويا كما يسمح هذا الأجنة إلى سدل بالكامل قبل التثبيت. هذا مهم بشكل خاص عند جمع الأجنة في مراحل مبكرة نسبيا (قبل الفقس)، منذ الأجنة عازمة صعبة للغاية لترتيب في الاتجاه المطلوب داخل غرفة في تصاعد مستمر. لم نشهد فقدان المناعة بعد MEMFA أو PFA تثبيت بالتالي إضافية خطوة استرجاع مستضد ليس من الضروري لهذا البروتوكول. وبالإضافة إلى ذلك، وهذايمكن أن يتم إجراء المناعية في عينات من مولد اللون / الفلورية في الموقع التهجين. في هذا السيناريو، فمن المستحسن لتخطي البروتيني K خطوة العلاج خلال الموقع في بروتوكول التهجين. بعد مولد اللون / الفلورسنت رد فعل الركيزة، والعينات ويمكن غسلها مع TBS وجزءا لا يتجزأ من حل الجيلاتين الأسماك بطريقة مشابهة لMEMFA / PFA عينات ثابتة. قارورة العينة يمكن أن تكون محمية من الضوء من خلال التفاف قارورة في رقائق الألومنيوم إذا كان سيتم تصويرها الفلورية في الموقع التهجين مع تلوين مناعي في وقت لاحق. في بعض الحالات، قد الأجنة يتقلص بشكل مفرط بعد اختراق الجيلاتين. وعلى الأرجح سبب ذلك إما غير كافية أو غير كافية تثبيت استخراج TBS-تريتون. ضمان أن الأجنة قد تم علاجها في PFA / MEMFA لمدة 2-3 على الأقل ساعة أو يفضل أن يكون بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. إذا استمرت المشكلة، وزيادة وقت غسل TBS-تريتون إلى 3 لمدة 1 ساعة. أثناء البرد التقطيعةنينغ، جمود كتلة عينة قد تختلف دفعات مختلفة اعتبارا من الجيلاتين الأسماك لها خصائص مختلفة. هذه المشكلة يمكن تعويضه جزئيا عن طريق ضبط درجة حرارة مشراح. وهناك انخفاض درجة الحرارة يؤدي إلى &quot;صعوبة&quot; كتلة عينة لكن تحت درجة حرارة منخفضة المفرطة يصبح كتلة العينة هش ويصعب القسم. بعض صقل أو ممارسة (باستخدام كتل عينة وهمية دون الأجنة) قبل كل باجتزاء قد يكون من المفيد قبل استخدامها على عينات قيمة خاصة. وهناك مشكلة تصادفها أثناء باجتزاء هي الشرائح الرقيقة تميل أحيانا إلى عصا على لوحة زجاجية سميكة بدلا من البقاء شقة في مرحلة الصلب. هذا يمكن أن يكون لا سيما تعطيل لأنه يقطع باستمرار عملية باجتزاء مستمرة. وعادة ما تسبب هذه الحالات من جانب واحد من سببين: غرفة الباب و (خصوصا) لوحة زجاجية سميكة لا يجري الباردة بما فيه الكفاية، أو الإفراط في تهمة ثابتة على الجهاز وسperator، خصوصا في الطقس الجاف. الأول يمكن حلها من خلال رفض درجة حرارة الجزء الغرفة وترك لوحة من الزجاج داخل لوقت اضافي (ربما بين عشية وضحاها). وهذا الأخير من خلال زرع جذور ناظم البرد بشكل صحيح. يمكن ربط السطح المعدني للناظم البرد إلى الاستفادة من المعدن أو نظام أنابيب المياه مماثلة مصنوعة من المعدن يكون وسيلة بديلة للافراج عن رسوم ثابتة. بعد كل استخدام، يجب غسلها لوحة زجاجية سميكة بشكل جيد مع المنظفات غير قابلة للتآكل (مثل سوائل غسل الاطباق)، تشطف بماء عالى النقاء، رش مع الإيثانول النقي، وملفوفة في منشفة ورقية لحماية سطح وحواف من الاضرار. الأجسام المضادة المدرجة في بروتوكول محددة عموما، ونحن نادرا ما تصادف الامتزاز غير محددة أو عالية إشارة الخلفية. وتجدر الإشارة إلى أنه في حالة استخدام الحرارة المعطل الماعز / لحم الضأن مصل كما منع وكيل، والإفراط في الحرارة تعطيل (كما تصور من قبل تشكيل مرسب رقيق في المصل) يجبينبغي تجنبها لأن هذا مرسب جذابة للغاية لالأجسام المضادة الثانوية ويمكن أن تسهم في مصدر خلفية عالية. ومن الممكن، والمطلوب في بعض الأحيان، لأداء مزدوج تلطيخ لتصور مجموعات مختلفة من الخلايا العصبية في وقت واحد. هذا المزدوج تلطيخ هو ممكن، ويعطي نتائج مرضية مع المجموعات التالية بشكل عام: Sox3 / N-الحوض أو / N-حوض Myt1. ومع ذلك، معقد المزدوج تلطيخ Sox3 وMyt1 من حقيقة أن الأجسام المضادة هما كلا من أصل أرنب. اختبرناها عدة مجموعات العلامات المباشرة الأجسام المضادة، ولكن لم يلاحظ أي نتائج مرضية (مستوى منخفض إشارة إلى الضوضاء)، وربما يعود ذلك إلى عدم وجود تضخيم إشارة من الأجسام المضادة الثانوية. كان أحد النهج الممكنة للتحايل على هذه المشكلة يكون لرفع خطوط المعدلة وراثيا في القيطم، كما هو مبين أدناه. واحدة من القيود الرئيسية لهذا البروتوكول هو أنه، في حين أن هذا البروتوكول يمكن فيه الكفاية ديstinguish حوضين رئيسيين من الخلايا العصبية، وهي تجمع الخلايا الجذعية العصبية، معربا عن Sox3 وMyt1، معربا عن الخلايا العصبية متباينة، إلا أنها تفتقر إلى القدرة على الكشف عن مختلف مجموعات فرعية من الخلايا العصبية متباينة. هؤلاء السكان من الباطن، والتي بما في ذلك، ولكن ليس على سبيل الحصر، الخلايا العصبية الحركية الأساسية، interneurons، والخلايا العصبية الحسية، وعادة ما تتميز الجينات علامة، وأعرب تفاضلي من 28-30. وكما ذكر أعلاه، التطورات الحديثة في تطوير متعدد الألوان في الموقع التهجين جنبا إلى جنب مع طريقة كشف المناعي القائم على الأجسام المضادة في الأجنة القيطم قد ملء الفجوة لكشف هؤلاء السكان من الباطن من الخلايا العصبية متباينة للتحقيق المحتملين 31. بدلا من ذلك، كما ثبت في نموذج الفئران، كما سيتم المطلوبة لرفع مجموعة أشمل من خلايا الأجسام المضادة من نوع معين لتمييز هؤلاء السكان خلية مختلفة في القيطم. أنهكما تجدر الإشارة إلى أن، كإضافة إلى هذا الأسلوب، التطورات الحديثة في التصوير الضوئي وتحليل الصور، مثل المجهر multiphoton والتعمير 3D، وتجزئة، ويمكن أيضا أن تطبق بعد التقديرات الأولية لتحقيق الملاحظات أشمل من البويضات القيطم وكذلك الأجنة المبكرة، لا سيما في ظل يعيش وضع 32،33. لذلك، لتتبع انتشار، والتمايز، وحركة الخلايا العصبية في الحيوانات الحية، فإن المستوى المطلوب لإنشاء واحد أو أكثر من خطوط المعدلة وراثيا التي تأوي البروتينات الفلورية يقودها نوع محدد خلية المروج للسماح للمراقبة حية لهؤلاء السكان الخلية في وقت مبكر القيطم الأجنة. إنشاء اكس. وقد وفرت خط المورق مع العصبية محدد β تويولين المروج القيادة tauGFP وتطبيقاته على سبيل المثال لطيفة 23،34. مع تسلسل المروج الكاملة للsox3 وmyt1 تتميز في الفقاريات 35-37، فمن شولد يكون من السهل نسبيا لإنشاء خطوط المعدلة وراثيا إضافية في القيطم التي ينبغي أن تساهم على نطاق واسع في كل من المجتمع القيطم ومجال أكثر العام للبحوث الخلايا العصبية الابتدائية.

في الفقاريات، وتطوير الجهاز العصبي المركزي وتشمل عدة مراحل مميزة بعد التوالي. الخطوة الأولى هي الحث العصبي، وعندما يتم تحديد خلايا الأدمة ساذجة نحو مصير العصبي بدلا من مصير البشرة. وتشارك عدة آليات تنظيمية مترابطة خلال هذه المرحلة في القيطم وأنظمة نموذج الأخرى 1،2. ويتم تنسيق هذه العملية في المقام الأول بسبب عوامل يفرز التي تنتجها الأديم المتوسط ​​الكامنة، مثل chordin، رأس، وفوليستاتين 3-7. بعد تحريض العصبي، مجموعة فرعية من الأسلاف العصبية الخروج من دورة الخلية وتبدأ في التفريق في العملية المشار إليها الخلايا العصبية كما الابتدائي. ليس كل السلائف العصبية تفرق في هذا الوقت. تستمر الخلايا العصبية السلائف المتبقية على التكاثر، وبالتالي الحفاظ على تجمع الخلايا الجذعية اللازمة لاستمرار نمو الجهاز العصبي المركزي في جميع أنحاء التنمية وفي مرحلة البلوغ. هذه العلاقات العامةoliferating الخلايا العصبية السلائف تتميز التعبير عنها من SRY (الجنس تحديد المنطقة Y) -box 3 (sox3) الجين 8-11. يتم تحديد سكانية أخرى من الخلايا، التي الخروج من دورة الخلية والالتزام مصير متباينة، من خلال التعبير عن علامات التمايز الجيني، تويولين، بيتا 2B الدرجة بنك الاستثمار الدولي (tubb2b، N-الحوض) والمايلين عامل النسخ 1 (myt1) 12-14. هذه الخلايا العصبية متباينة في نهاية المطاف تؤدي إلى فئات مختلفة من الخلايا العصبية بما في ذلك، ولكن ليس على سبيل الحصر، والسيارات، المشترك بين، والخلايا العصبية الحسية المتمركزة في مناطق متميزة داخل الأنبوب العصبي 15-17. في حين تم بذل جهود كبيرة لكشف الآليات التنظيمية التي تحكم الزخرفة ومصير تحديد الأحداث في الأديم الظاهر العصبي الأمامي، أحرز اهتماما أقل على التحقيق في الأحداث العصبية التي تحدث بعدمرحلة الزخرفة الأولية. في الواقع، نقل الإشارة واللوائح النسخي، وكذلك التعديلات بعد متعدية وجميع المشاركين في هذه المرحلة في وقت لاحق، والسيطرة على كل من توقيت والنسب مواصفات خلال تكوين الخلايا العصبية 18-20. وتتطلب المزيد من التحقيقات في هذه الآليات وسيلة يمكن الاعتماد عليها لتصور بسهولة وتميز مجموعات مختلفة من الخلايا العصبية. N-الحوض المذكور أعلاه علامات العصبية، بما في ذلك، Sox3، Myt1، و، يمكن أن توفر وسيلة للتعرف على هؤلاء السكان مختلفة من الخلايا، وبالتالي توفير الأسس اللازمة للكشف عن الآليات الكامنة وراء تمايز الخلايا العصبية 21-23. وعلى الرغم من تظاهر العلامات التفاضلية للسكان الخلية العصبية في الكائنات نموذج أخرى، استغل عدد قليل نسبيا من الدراسات النظام القيطم على أكمل وجه في هذا الصدد. ويرجع ذلك أساسا إلى قلة من الأجسام المضادة متوافقة التي تحدد موثوق neur مختلفالسكان الخلية اونال في الأنبوب العصبي. هنا، نحن تصف طريقة لتصور تمايز الخلايا العصبية في الأجنة القيطم في وقت مبكر عن طريق المناعية، التي توفر نهجا قويا ومريحة للتحقيق في تكوين الخلايا العصبية الابتدائية في القيطم. هذا البروتوكول يجب أن تعطي توجيهات كافية للباحثين المهتمين في التنمية في وقت مبكر من الجهاز العصبي المركزي القيطم بين مرحلة ومرحلة 26 45.

<table><tbody><tr><td>جنتاميسين&nbsp;</td><td>سيجما ألدريتش</td><td>G1397</td><td></td></tr><tr><td>تريس-حمض الهيدروكلوريك &nbsp;</td><td>سيجما ألدريتش</td><td>T3253</td><td></td></tr><tr><td>تريس قاعدة</td><td>سيجما ألدريتش</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>كلوريد الصوديوم &nbsp ؛</td><td>سيجما ألدريتش</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>سيجما ألدريتش</td><td>746436</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td> <td>سيجما ألدريتش</td><td>746452</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2 سيجما</td> <td>ألدريتش</td><td>793639</td><td></td></tr><tr><td>هيبس</td><td>سيجما ألدريتش</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>MOPS</td><td>سيجما ألدريتش</td><td>RDD003</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>سيجما ألدريتش</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>37٪ فورمالديهايد &nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8775</td><td></td></tr><tr><td>الجيلاتين من جلد السمك في الماء البارد</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7765</td><td></td></tr><tr><td>السكروز</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7903</td><td></td></tr><tr><td>قالب قاعدة يمكن التخلص منه 15 مم × 15 مم × 5 مم Simport</td><td>VWR</td><td>EMB-200-015A</td><td></td></tr><tr><td>قالب قاعدة يمكن التخلص منه 7 مم × 7 مم × 5 مم Simport</td><td>VWR</td><td>EMB-200-010K</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost Plus</td> <td>شرائحThermoFisher</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>وسط تجميد الأنسجة (OCT)</td><td>Leica&nbsp;</td><td>14020108926</td><td></td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>Leica&nbsp;</td><td>CM3050</td><td></td></tr><tr><td>قفازات</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>الثلج</td><td></td><td></td><td></td>الجاف</tr><tr><td>Triton X-100 &nbsp ؛</td><td>سيجما ألدريتش</td><td>X100</td><td></td></tr> <tr><td>&nbsp ؛ 85-90 درجة ؛ C كتلة</td><td></td><td></td><td></td>حرارية</tr><tr><td>قلم PAP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z377821</td><td></td></tr><tr><td>الأسيتون ، درجة</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>تحليلية جرة تلطيخ مع رفوف</td><td></td><td></td><td></td>منزلقة</tr><tr><td>صندوق طعام بحجم مناسب (لديه القدرة على استيعاب 1-2 6 آبار من الداخل)</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>التوبولين المضاد للأستيلات</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T7451</td><td></td></tr><tr><td>مكافحة الماوس IgG (H+L), F(ab')2&nbsp; جزء (Alexa Fluor&reg; &nbsp; 488 مترافقة)</td> <td>إشارات الخلية</td><td>4408</td><td></td></tr><tr><td>IgG المضادة للأرانب (H + L) ، F (ab') 2 &nbsp ؛ جزء (Alexa Fluor&reg; &nbsp; 555 مترافقة)</td> <td>إشارات الخلية</td><td>4413</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor & reg ؛ 647</td><td>إشارات خلية</td> الفالودين <td>8940</td><td></td></tr><tr><td>إشارات خلية</td><td>DAPI</td><td>4083</td><td></td></tr><tr><td>تقنيات عمر التثبيت المضاد للتلاشي الذهبي</td><td></td><td>P36930</td><td></td></tr></tbody></table>

تقييم تكوين الخلايا العصبية الابتدائية في<em&gt; القيطم</em&gt; الأجنة عن طريق المناعية

Assessing Primary Neurogenesis in Xenopus Embryos Using Immunostaining

تكوين الخلايا العصبية الأولية هو عملية ديناميكية ومعقدة أثناء التطور الجنيني تحدد التخطيط الأولي للجهاز العصبي المركزي. خلال هذه العملية ، يخضع جزء من الخلايا الجذعية العصبية للتمايز ويؤدي إلى ظهور المجموعات الأولى من الخلايا العصبية الأولية المتمايزة داخل الجهاز العصبي المركزي الناشئ. تم استخدام العديد من الكائنات الحية النموذجية للفقاريات لاستكشاف آليات تحديد مصير الخلايا العصبية والنمذجة والتمايز. من بين هذه الضفدع الأفريقي المخالب ، Xenopus ، الذي يوفر نظاما قويا للتحقيق في الآليات الجزيئية والخلوية المسؤولة عن تكوين الخلايا العصبية الأولية بسبب تطوره السريع ويمكن الوصول إليه وسهولة التلاعب الجنيني والجزيئي. هنا ، نقدم طريقة مريحة وسريعة لمراقبة المجموعات السكانية المختلفة للخلايا العصبية داخل الجهاز العصبي المركزي Xenopus. باستخدام تلطيخ الأجسام المضادة والتألق المناعي على أقسام من أجنة Xenopus ، يمكننا مراقبة مواقع الخلايا الجذعية العصبية والخلايا العصبية الأولية المتمايزة أثناء تكوين الخلايا العصبية الأولي.

وتظهر نتائج ممثلة المقاطع العرضية من المرحلة 30 الأجنة القيطم على مختلف المستويات، وهي مقدمة الدماغ، الدماغ المتوسط، الدماغ المؤخر، والحبل الشوكي، ملطخة الأجسام المضادة المختلفة (الشكل 4). كما ذكرنا، Sox3 المسمى يقع العصبية السكان خلية سلفية في المناطق القريبة من تجويف الأنبوب العصبي، في حين MyT1 المسمى الخلايا العصبية الأولية متباينة تهاجر إلى الخارج وتحديد موقع بالقرب من طبقة هامشية (الصفيحة القاعدية) في الأنبوب العصبي. مكافحة أسيتيل تويولين تسميات المحاور في الخلايا العصبية متباينة، والتي يمكن ملاحظتها داخل الأنبوب العصبي بأكمله. الجانب محددة إسقاط الموروثة أو overexpression هو الطريقة المستخدمة على نطاق واسع في علم الأعصاب لتقييم ما إذا تحوير التعبير عن جين معين (ق) يعطل نمو وتمايز الخلايا العصبية. في مثل هذه الحالات، إما Morpholinos (موس) أو بناء الحمض النووي (ق) يحمل الموالية<html> يتم حقن الجينات يحركها moter (ق) في واحدة من اثنين عن Blastomeres في مرحلة الخلية اثنين 23. بدلا من ذلك، فإنها يمكن حقنها في البطين الدماغ تليها Electroporation لل، الأمر الذي سيؤدي إلى ضربة قاضية أو الإفراط في التعبير عن الجين المطلوب (ق) 27. في كلتا الحالتين، سوف تقتصر آثار على جانب واحد من الجنين، مما يجعل الجانب الآخر من الجنين كما الرقابة الداخلية غير المعالجة. بعد التثبيت، باجتزاء، والمناعية، وكميا آثار ضربة قاضية الجينات / الإفراط في التعبير عن طريق العد ومقارنة أعداد الخلايا من مختلف قطاعات السكان في كلا الجانبين من الجنين. من خلال تجميع هذه البيانات من عدة أجنة، لا يمكن أن يؤديها التحليل الإحصائي. في نتائج تمثيلية لدينا، لم يحرز أي اضطراب في الأجنة. أمثلة من اضطراب الجينات وتأثيراتها على مختلف السكان الخلية العصبية ويمكن الاطلاع في المراجع 20،23. ر &quot;FO: المحافظة على together.within الصفحات =&quot; 1 &quot;&gt; <img alt="الشكل 1" src="/files/ftp_upload/53949/53949fig1.jpg" /> الشكل 1: ترتيب الأجنة وتوجيهه في قسم العفن (A) وتصوير كاريكاتوريا يظهر الجمعية متزايدة، لاحظ وقد وصفت علبة مع التاريخ، والمسرح، والتوجه للأجنة. (ب) صورة تظهر مظهر طبيعي للجمعية المتزايدة. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53949/53949fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/53949/53949fig2.jpg" /> الشكل 2: توجه وموقف كتلة الجيلاتين على القرص عينة عقد (A) وتصوير كاريكاتوريا يظهر الجمعية قسم كتلة، لاحظ أن الأجنة في موقف &quot;يرأس&quot; وكتلة الجيلاتين ورسخت سn لقرص عقد عينة من متوسطة تجميد الأنسجة في القاعدة (انظر الشكل 2B). (ب) صورة تظهر مظهر طبيعي من كتلة التجمع القسم، لاحظ تراكم المتوسطة تجميد الأنسجة بين كتلة الجيلاتين والقرص عينة القابضة. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53949/53949fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل (3)" src="/files/ftp_upload/53949/53949fig3.jpg" /> الرقم 3: باجتزاء المستمر (A) نموذج لقسم الدائرة. يجب أن تكون استدارة القرص عقد العينة وثابتة على موقف الجانب الجنين يكون مواجها لها. بعد بضع (6-10) أقسام، يتم فصل شريط طويل من البلاط قسم المستمرة بلطف من شفرة (الأزرق) باستخدام فرشاة دقيقة، ثم تحول 90 درجة على لوحة القابضة. ثم اتهم غرفة درجة الحرارة بشكل إيجابي الشريحةضغطت بقوة على الباب شريط أسفل ورفعت فورا إلى شرائح النهائية التي تم جمعها. (ب) عادة، كل شريحة يمكن أن تستوعب 2 خطوط متوازية من الشرائط، كما هو مبين. تذكر لجعل سجل مفصل على التسمية الشريحة باستخدام قلم رصاص. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53949/53949fig3large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل (4)" src="/files/ftp_upload/53949/53949fig4.jpg" /> الشكل 4: المقطع العرضي للمرحلة 30 اكس. المورق الضفادع الصغيرة وتلطيخ في الأنسجة العصبية، 20X. (A) الخطط التي تشير إلى مناصب النسبية (الدماغ الأمامي، الدماغ المتوسط، الدماغ المؤخر، والحبل الشوكي) من قسم الطائرات على الضفادع الصغيرة القيطم. (ب) المقابلة المقاطع العرضية ملطخة مكافحة Sox3 (الأحمر)، ومكافحة الأسيتيل تويولين (GREEn)، ودابي (الأزرق)، والتي تبين مواقع النسبية للحمامات الخلايا الجذعية العصبية وكذلك neurofilaments داخل الأنبوب العصبي. (C) الموافق المقاطع العرضية ملطخة مكافحة MyT1 (الأحمر) ودابي (الأزرق)، والتي تبين مواقع النسبية من الخلايا العصبية الأولية المتباينة داخل الأنبوب العصبي. شريط النطاق = 20 ميكرون. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53949/53949fig4large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

تقدم هذه المقالة طريقة مريحة وسريعة لتصور مختلف السكان الخلية العصبية في الجهاز العصبي المركزي للأجنة القيطم باستخدام مناعي تلطيخ على أقسام.

Primary neurogenesis is a dynamic and complex process during embryonic development that sets up the initial layout of the central nervous system. During ...

الهدف العام من هذه التجربة هو إتاحة التصوير السريع والمريح لمجموعات مختلفة من الخلايا العصبية في دماغ جنين Xenopus النامي. يمكن أن تساعد هذه الطرق في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجال تكوين الخلايا العصبية الأولية، مثل مراقبة عملية تنظيم التمايز العصبي في الجهاز العصبي المركزي لـ Xenopus. وتكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية في أنها تسمح بالمراقبة المتزامنة لمجموعة الخلايا السلفية الجذعية العصبية، بالإضافة إلى مجموعة عصبية أولية متمايزة ضمن تجربة واحدة.لبدء هذا الإجراء، اسحب بعناية من خمسة إلى عشرة أجنة من القارورة الزجاجية باستخدام ماصة بلاستيكية أو زجاجية دون إدخال فقاعات هوائية. انقل الأجنة إلى غرفة التثبيت وافحصها تحت المجهر الستيريو. املأ غرفة التثبيت بمحلول الجيلاتين لضمان صلابة كتلة المقطع.بعد ذلك، رتّب الأجنة جنباً إلى جنب باستخدام ملقط دقيق الرأس. حدد اتجاه الرأس برسم سهم على حافة الغرفة باستخدام قلم تحديد متوافق مع درجات الحرارة المنخفضة. وفي حال وجود مجموعات متعددة من الأجنة، دوّن وصف كل مجموعة على حافة الغرفة المقابلة لها.بعد ذلك، ضع الحجرة بعناية وبشكل أفقي في صندوق رغوي مملوء إلى النصف بالثلج الجاف. أغلق الغطاء، واترك كل حجرة تثبيت تتجمد على حدة لمدة تتراوح من خمس إلى عشر دقائق. بعد ذلك، ابدأ بعملية القطع بالتجميد أو احتفظ بالعينات المجمدة في درجة حرارة 80 درجة مئوية لمدة أسبوع إلى أسبوعين على الأقل دون فقدان القدرة المناعية.في هذا الإجراء، قم بإزالة كتلة العينة المجمدة من الحجرة عن طريق الضغط على الجزء السفلي من الحجرة باستخدام عود غير مدبب أو الإصبع. بعد ذلك، أضف عدة قطرات من وسط تجميد الأنسجة على قرص تثبيت العينة. قم بتثبيت كتلة العينة بحيث يكون الطرف الأمامي للأجنة متجهاً للأعلى، واترك الكتلة المثبتة داخل حجرة الميكروتوم المجمد (cryostat) لمدة دقيقة واحدة تقريباً، أو حتى يصبح وسط تجميد الأنسجة عتامياً.قم بتركيب قرص تثبيت العينة على الميكروتوم فوراً بحيث يكون الجانب السفلي من كتلة العينة موجهاً للأعلى. قم بقص جزء من كتلة العينة باستخدام الشفرة بينما لا تزال الكتلة لينة نسبياً. بعد ذلك، اترك قرص تثبيت العينة على الميكروتوم لمدة خمس دقائق على الأقل حتى تصل درجة حرارته إلى حالة الاتزان.بعد ذلك، قم بتقليم كتلة العينة تدريجياً حتى تصبح رؤوس الشراغيف مرئية من خلال الجيلاتين الشفاف. ولزيادة سرعة التقليم، قم بزيادة سمك القطاع. راقب أداء الميكروتوم المجمد (cryostat)، مثل حدة الشفرة وزاويتها، لضمان إنتاج القطاعات اللاحقة في شريط طويل.بمجرد أن تصبح رؤوس الشراغف مرئية، قم بإعادة ضبط إعدادات الميكروتوم بالتجميد (cryostat) إلى الوضع الطبيعي، وذلك لضمان أن المقاطع النهائية تشكل شرائط ولا تتداخل أو تلتصق بالشفرة. ثم استمر في التشذيب حتى تصبح رؤوس الشراغف مكشوفة تقريبًا. قم بإزالة أي مقاطع متبقية عن المنصة باستخدام الفرشاة قبل البدء في جمع مقاطع العينات.قم بإعداد ما يقرب من 10 إلى 15 مقطعاً واجعلها تشكل شريطاً طويلاً. اقلب لوح غطاء الشريحة السميك إلى الجانب وأزل الشريط برفق من الشفرة باستخدام فرشاة رسم ذات سن رفيع. بعد ذلك، رتب الشريط على المنصة بحيث يكون المحور الطولي موازياً للشفرة.قم بإعداد من 10 إلى 15 مقطعاً واجعلها تشكل شريطاً طويلاً دون انقطاع. قد لا يكون الأمر سهلاً ويتطلب ممارسة؛ إحدى الحيل هي محاولة عدم تدوير العجلة اليدوية بسرعة عالية جداً.بل قم بتدوير العجلة اليدوية بعناية وببطء. بعد ذلك، اختر شريحة مشحونة إيجابياً في درجة حرارة الغرفة وقم بتمييزها باستخدام قلم رصاص. ثم اضغط عليها بسرعة وبقوة فوق الشريط بحيث يكون الجانب المميز متجهاً للأسفل.بعد ذلك، أخرج الشريحة من غرفة الميكروتوم المجمد (cryostat). كرر هذه الخطوة لترتيب من 20 إلى 30 مقطعاً بشكل متوازٍ على كل شريحة. اترك الجوانب لتجف في الهواء لمدة 10 دقائق، ثم انتقل فوراً إلى إجراء الصبغ المناعي أو احفظ الشرائح في صندوق شرائح عند درجة حرارة 80 درجة مئوية لمدة تصل من ثلاثة إلى ستة أشهر قبل إجراء الصبغ المناعي.نرى هنا مستويات القطاعات المقابلة للدماغ الأمامي، والدماغ المتوسط، والدماغ الخلفي، والنخاع الشوكي لشرغوف Xenopus، والتي ستُستخدم لتوفير مراجع موضعية للصور التالية. وتُظهر المقاطع العرضية المقابلة، والتي صُبغت باستخدام Anti-Sox 3 و Anti-Acetylated Tubulin و DAPI، المواقع النسبية لمجمعات الخلايا الجذعية العصبية بالإضافة إلى الخيوط العصبية داخل الأنبوب العصبي. وهنا تظهر المقاطع العرضية المقابلة المصبوغة بـ Anti-MyT1 و DAPI، والتي تبين المواقع النسبية للعصبونات الأولية المتمايزة داخل الأنبوب العصبي.بمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن إنجازها في غضون ساعتين إذا نُفذت بشكل صحيح. وأثناء محاولة تطبيق هذا الإجراء، من المهم تذكر ضمان توفير وقت تبريد كافٍ لكتلة العينة في الثلج الجاف؛ وإلا فقد لا تكون كتلة العينة صلبة بما يكفي، مما يجعل عملية القطع صعبة.بعد تطوير هذه التقنية، مهدت الطريق للباحثين في مجال العلوم العصبية التنموية لاستكشاف التمايز العصبي في الجهاز العصبي المركزي لضفادع الـ xenopus. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية عمل المقاطع العرضية، ومراقبة مجموعات محددة من الخلايا العصبية في الجهاز العصبي المركزي لضفادع الـ xenopus.

assessing-primary-neurogenesis-in-xenopus-embryos-using-immunostaining

Research

JoVE Journal

Neuroscience

علم الأعصاب

الحث العصبي هو الخطوة الأولى في تكوين الدماغ. وهو الآلية التي عقدة هنسن (المنظم) ، يرشد النسيج المجاور لاعتماد مصير العصبية ، أي أن تثير الجهاز العصبي. هذا الفيديو يوضح مقايسة لتحريض العصبي في الأجنة الفرخ.

مقايسة لتحريض العصبية في الأجنة الفرخ

electroporation في الرحم هو وسيلة قيمة لtransfecting الخلايا الاصلية العصبية في الجسم الحي. تبعا للوضع الأقطاب وtimepoint التنموية للelectroporation ، يمكن استهداف مجموعات فرعية معينة من الخلايا القشرية. ويمكن بعد ذلك أن تحلل الخلايا المستهدفة في الجسم الحي أو في المختبر لآثار التغير الجيني.

في الرحم بعد Electroporation للثقافة متعلق بالخلايا العصبية الأولية لدراسة وظائف الجينات في مجموعة فرعية من العصبونات القشرية

السيطرة على التوسع في الخلايا الجذعية الجسدية هو أحد العوامل الرئيسية التي تعوق دراستهم واستخدامها في العلاج. نحن هنا وصف نظام للسيطرة على التوسع زمنيا العصبية خلال الخلايا الجذعية التنمية والبلوغ، والتي يمكن استخدامها لزيادة عدد الخلايا العصبية في الدماغ ولدت الماوس.

توسيع الجنينية والكبار الخلايا الجذعية العصبية من قبل<em&gt; في الرحم</em&gt; الصعق الكهربائي أو حقن التجسيمي الفيروسية

يوضح الفيديو طريقة تلطيخ التألق المناعي المستخدمة لفحص تكوين الخلايا العصبية في الحصين البالغ. في البداية ، يخضع قسم دماغ الفأر للعلاج بالأجسام المضادة الأولية الموجهة إلى بروتينات العلامة المرتبطة بتكوين الخلايا العصبية في الخلايا السلفية العصبية. بعد ذلك ، يتم تصنيفها بأجسام مضادة ثانوية موسومة بالفلوروفورات. ثم تتم ملاحظة قسم الدماغ تحت المجهر متحد البؤر للتمييز بين الأنواع الفرعية المختلفة من الخلايا السلفية ، بناء على أنماط التعبير عن مجموعات متميزة من بروتينات الواسم.

تقنية تلطيخ التألق المناعي للكشف عن تكوين الخلايا العصبية في الحصين لدى البالغين

يوضح هذا الفيديو إجراء تلطيخ الخلايا الجذعية العصبية المتكاثرة حديثا في أقسام أنسجة المخ باستخدام دمج EdU ، متبوعا بالتألق المناعي لتصور بروتينات معينة ، مما يعزز فهم ديناميكيات الخلايا والانتشار.

تلطيخ التألق المناعي لتصور الخلايا الجذعية العصبية المتكاثرة في أقسام دماغ الفئران

توضح مقالة الفيديو هذه بروتوكولا شاملا لاكتشاف وتحديد جميع مراحل تكوين الخلايا العصبية للحصين البالغين داخل نفس قسم الأنسجة. لقد وضعنا طريقة للتغلب على قيود التألق المناعي المتعدد غير المباشر التي تنشأ عندما لا تتوفر أجسام مضادة مناسبة من أنواع مضيفة مختلفة.

المناعية وصفها متعددة مع الأجسام المضادة من نوع المضيف نفسه لدراسة الكبار الحصين تكوين الخلايا العصبية

هنا نصف إجراء يعتمد على استخدام جزيئات الفيروسات العدسية للتعديل الجيني طويل المدى للخلايا الجذعية العصبية و / أو الخلايا البطانية العصبية المجاورة لها في مكانة عصبية البطين تحت البطين البالغة والتي تسمح بتحليل منفصل للخلايا المستقلة وغير المستقلة والمعتمدة على الخلايا الجذعية العصبية.

مستقر وكفاءة التحوير الوراثي للخلايا في الكبار ماوس V-SVZ لتحليل العصبية الخلايا الجذعية الذاتية الحكم والآثار لغير المتمتعة بالحكم الذاتي

في أجنة Xenopus ، تكون الخلايا من سقف الأريمية متعددة القدرات ويمكن برمجتها لتوليد أنسجة مختلفة. هنا ، نصف بروتوكولات استخدام مصانع سقف الأريمة البرمائية كنظام فحص للتحقيق في الميزات الرئيسية في الجسم الحي وفي المختبر للتطور العصبي المبكر.

الخلايا الجذعية مثل<em&gt; القيطم</em&gt; الجنينية إإكسبلنتس إلى الدراسة في وقت مبكر العصبية التنموية الميزات<em&gt; في المختبر</em&gt; و<em&gt; في فيفو</em

الهدف من هذا البروتوكول هو وصف نهج لتحليل سلوك الخلايا الجذعية العصبية الكبار / الخلايا السلف ردا على التلاعب الكيميائي من دائرة عصبية محلية محددة.

مراقبة الدائرة تنظيم محدد من خلايا السلائف العصبية فرس النهر الكبار

نقدم بروتوكولًا من جزئين يجمع بين تصوير الكالسيوم الفلوري مع التهجين في الموقع ، مما يسمح للمجرب بربط أنماط نشاط الكالسيوم بملفات تعريف التعبير الجيني على مستوى خلية واحدة.

تصوير الكالسيوم الفلوري والتهجين في الموقع اللاحق لتوصيف السلائف العصبية في زينوبوس laevis

تقدم هذه الورقة أربعة من أكثر التقنيات شيوعا لتصور الخلايا الإيجابية BrdU لقياس تكوين الخلايا العصبية البالغة في الفئران. يتضمن هذا العمل تعليمات لإعداد الكاشف ، وإدارة الثيميدين التناظرية ، والتروية عبر القلب ، وإعداد الأنسجة ، والتفاعل الكيميائي المناعي للبيروكسيديز ، والتألق المناعي ، وتضخيم الإشارة ، والتلوين المضاد ، والتصوير المجهري ، وتحليل الخلايا.

تقنيات الكيمياء الهيستولوجية المناعية لتحليل الانتشار الخلوي وتكوين الخلايا العصبية في الفئران باستخدام Thymidine Analog BrdU

اكتشف طريقة سريعة لتصور الخلايا العصبية في أجنة Xenopus باستخدام التلطيخ المناعي. تتيح هذه التقنية رؤية تجمعات الخلايا الجذعية العصبية والخلايا العصبية المتمايزة في تجربة واحدة.

تقييم تكوين الخلايا العصبية الابتدائية في

استكشف المزيد من الفيديوهات