تقييم تكوين الخلايا العصبية الابتدائية في القيطم الأجنة عن طريق المناعية

الهدف العام من هذه التجربة هو السماح بالتصور السريع والمريح لمجموعات مختلفة من الخلايا العصبية في الدماغ الجنيني xenopus النامي. يمكن أن تساعد هذه الأساليب في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال تكوين الخلايا العصبية الأولية ، مثل مراقبة عملية تنظيم التمايز العصبي في الجهاز العصبي المركزي xenopus. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تسمح بالمراقبة المتزامنة لمجموعة سلف الخلايا الجذعية العصبية ، بالإضافة إلى تجمع عصبي أولي متمايز في تجربة واحدة.

لبدء هذا الإجراء، استنشق بعناية من خمسة إلى عشرة أجنة من القارورة الزجاجية باستخدام ماصة بلاستيكية أو زجاجية دون إدخال فقاعات هواء. انقل الأجنة إلى غرفة التركيب وراقب تحت مجسم املأ غرفة التركيب بمحلول الجيلاتين لضمان صلابة كتلة المقطع.

بعد ذلك ، رتب الأجنة جنبا إلى جنب باستخدام زوج من الملقط ذي الأطراف الدقيقة. حدد اتجاه الرأس عن طريق رسم سهم على حافة الغرفة باستخدام علامة متوافقة مع التبريد. بالنسبة لمجموعات متعددة من الأجنة ، اكتب وصف كل مجموعة على حافة الغرفة المقابلة.

ثم ضع الغرفة بعناية أفقيا في صندوق رغوي نصف مملوء بالثلج الجاف. أغلق الغطاء واترك حجرة التثبيت تتجمد واحدة تلو الأخرى لمدة خمس إلى عشر دقائق. بعد ذلك ، استمر في التقطيع بالتبريد أو احتفظ بالعينات المجمدة عند 80 درجة مئوية لمدة أسبوع إلى أسبوعين على الأقل دون فقدان المناعة.

في هذا الإجراء ، قم بإزالة كتلة العينة المجمدة من الغرفة بالضغط على الجزء السفلي من الغرفة باستخدام عصا حادة أو إصبع. ثم أضف عدة قطرات من وسط تجميد الأنسجة إلى قرص تثبيت العينة. قم بتركيب كتلة العينة مع توجيه الطرف الأمامي للأجنة لأعلى والسماح للكتلة المثبتة بالوقوف داخل غرفة التبريد لمدة دقيقة واحدة تقريبا ، أو حتى يصبح وسط تجميد الأنسجة معتما.

قم بتثبيت قرص تثبيت العينة على الفور على الميكروتوم بحيث يكون الجانب السفلي من كتلة العينة متجها لأعلى. قم بقص جزء من كتلة العينة باستخدام شفرة عندما لا تزال كتلة العينة ناعمة نسبيا. بعد ذلك ، اترك قرص الاحتفاظ بالعينة على الميكروتوم لمدة خمس دقائق على الأقل للسماح لدرجة حرارته بالوصول إلى التوازن.

بعد ذلك ، قم بقص كتلة العينة تدريجيا حتى تظهر رؤوس الضفادع الصغيرة من خلال الجيلاتين الشفاف. لزيادة سرعة التشذيب ، قم بزيادة سمك القسم. راقب أداء ناظم البرد، مثل حدة الشفرة وزاويتها، للتأكد من إنشاء الأقسام اللاحقة في شريط طويل.

بمجرد أن تظهر رؤوس الشرغوف ، اضبط إعدادات ناظم البرد مرة أخرى إلى وضعها الطبيعي ، للتأكد من أن الشرائح النهائية يمكن أن تشكل شرائط وليست متداخلة أو تلتصق بالشفرة. ثم استمر في التشذيب حتى تتعرض رؤوس الضفادع الصغيرة تقريبا. قم بإزالة أي أقسام متبقية على المسرح قبل البدء في جمع أقسام العينة.

اصنع ما يقرب من 10 إلى 15 قسما واتركها تشكل شريطا طويلا. اقلب اللوح الزجاجي السميك إلى الجانب وقم بإزالة الشريط برفق من الشفرة باستخدام فرشاة رسم ذات طرف رفيع. بعد ذلك ، رتبها على المسرح مع المحور الطويل الموازي للشفرة.

اصنع من 10 إلى 15 قسما واتركها تشكل شريطا طويلا دون أن تنكسر. قد لا يكون الأمر سهلا ويتطلب ممارسة. إحدى الحيل هي محاولة عدم تطبيق السرعة عالية جدا على العجلة اليدوية.

بدلا من ذلك ، قم بتدوير العجلة اليدوية بعناية وببطء. بعد ذلك ، اختر شريحة واحدة موجبة الشحنة في درجة حرارة الغرفة وقم بتسميتها بقلم رصاص. ثم اضغط عليه بسرعة وثبات على الشريط بحيث يكون الجانب الملصق متجها لأسفل.

بعد ذلك ، قم بإزالة الشريحة من غرفة ناظم البرد. كرر هذه الخطوة لترتيب 20 إلى 30 شريحة بالتوازي على كل شريحة. جفف الجوانب بالهواء لمدة 10 دقائق ، ثم انتقل على الفور إلى إجراء التلوين المناعي أو قم بتخزين الشرائح في صندوق منزلق عند 80 درجة مئوية لمدة تصل إلى ثلاثة إلى ستة أشهر قبل إجراء التلوين المناعي.

هنا ، يمكننا أن نرى مستويات المقطع المقابلة للدماغ الأمامي والدماغ المتوسط والدماغ الخلفي والحبل الشوكي للشرغوف xenopus والتي سيتم استخدامها لتوفير مراجع موضعية للصور التالية. تظهر المقاطع العرضية المقابلة ، والتي تم تلطيخها ب Anti-Sox 3 ، و Anti-Acetylated Tubulin ، و DAPI المواقع النسبية لتجمعات الخلايا الجذعية العصبية بالإضافة إلى الخيوط العصبية داخل الأنبوب العصبي. وإليك المقاطع العرضية المقابلة الملطخة ب Anti-MyT1 و DAPI والتي تظهر المواقع النسبية للخلايا العصبية الأولية المتمايزة داخل الأنبوب العصبي.

بمجرد إتقانها ، يمكن القيام بهذه التقنية في غضون ساعتين إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر ضمان وقت تبريد كاف لكتلة العينة في الثلج الجاف. خلاف ذلك ، قد لا تكون كتلة العينة صلبة بما فيه الكفاية وبالتالي يصعب قطعها.

بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال علم الأعصاب التنموي لاستكشاف التمايز العصبي في الجهاز العصبي المركزي xenopus. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية عمل أقسام ، ومراقبة مجموعات محددة من الخلايا العصبية في الجهاز العصبي المركزي xenopus.