فحوصات لتدهور تتجمع البروتينات في الخلايا

يصف هذا التقرير بروتوكولات لقياس معدلات تدهور البروتينات غير المطوية إما عن طريق اللطخة الغربية أو المقايسات القائمة على الفلورة. يمكن تطبيق الطرق لتحليل البروتينات الأخرى غير المطوية ولفحص الإنتاجية العالية.

الهدف العام من هذا الاختبار هو قياس معدلات التحلل الخلوي للبروتينات غير المطوية. ترتبط البروتينات غير المطوية بالعديد من الأمراض التنكسية العصبية. يساعد هذا الاختبار على التحقيق في أنظمة مراقبة جودة البروتين الخلوي التي تعتبر واقية من البروتينات الشاذة.

قد توجد البروتينات المعرضة للطي بأشكال مختلفة في الخلايا. من خلال الجمع بين تجزئة الخلايا ومطاردة طريقة الهكسان الحلقي ، فإن الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي قياس عمر النصف للأنواع غير المطوية على وجه التحديد. نستخدم اثنين من البروتينات النموذجية كأمثلة.

بروتين بولي جلوتامات شديد التراكم ، Atxn1 82Q وطفرة لوسيفيراز نووية غير مستقرة بشكل توافقي. يمكن أيضا تطبيق البروتوكول على قياسات البروتين الأخرى غير المطوية. لإجراء اختبار تحلل ل Atxn1 82Q GFP ، قم بلوحة ما يقرب من 3x10 ^ 5 خلايا HeLa في ألواح 35 ملم مع وسيط DMEM و 10٪ FBS.

احتضان الخلايا طوال الليل بحيث تصل إلى التقاء 40 إلى 60٪ في وقت التعدي. بعد أربع إلى خمس ساعات من نقل الخلايا باستخدام Atxn1 82Q GFP PRK5 ، تحت مجهر الإزهار ، استخدم طولا موجيا للإثارة يتراوح من 450 إلى 490 نانومتر لفحص الخلايا الحية للتعبير عن GFP في النوى ، والتي تتميز بوجود بقع منتشرة وصغيرة من إشارات GFP. قبل علاج cycloheximide مباشرة ، قم بحصاد صفيحة واحدة من الخلايا عن طريق إزالة الوسط واستخدام ثلاثة ملليلتر من PBS المثلج البارد لغسل الخلايا مرتين.

ثم قم بتجميد الطبق على الثلج الجاف. بالنسبة للألواح المتبقية من الخلايا ، قم بإزالة الوسط عن طريق الشفط بالفراغ وأضف ملليلترين من DMEM الطازج الذي يحتوي على 50 ميكروغراما لكل مليلتر من السيكلوهكسيميد. أضف أيضا 10 ميكرومولار من مثبط البروتيازوم MG132 إلى طبق واحد.

احتضان الخلايا المعالجة لمدة أربع وثماني و 12 و 16 ساعة قبل التجميد على الثلج الجاف. بعد حصاد الخلايا المعالجة MG132 في 16 ساعة ، اكشط الخلايا المجمدة من جميع الألواح إلى 150 ميكرولتر من محلول تحلل الخلايا الباردة المثلجة واحتضانها على الجليد لمدة 30 دقيقة. جهاز الطرد المركزي في جهاز طرد مركزي على الطاولة عند 17 ، 000 × جم وأربع درجات مئوية لمدة 15 دقيقة.

ثم انقل المادة الطافية التي تحتوي على بروتينات MP40 القابلة للذوبان إلى أنبوب آخر. اشطف الكريات بإضافة ما يقرب من 200 ميكرولتر من 1x PBS إلى الأنابيب دون إزعاج الكريات. قم بإزالة PBS بعناية عن طريق الشفط أو الماصة ، وأعد تعليق الكريات في 150 ميكرولتر من محلول الحبيبات المثلج البارد ثم احتضانها على الجليد لمدة 15 إلى 30 دقيقة.

بعد ذلك ، أضف 75 ميكرولترا من مخزن مؤقت للغليان 3x إلى كسور قابلة للذوبان MP40 وكسور MP40 غير القابلة للذوبان المعلقة من الكريات. ثم سخني العينات على 95 درجة مئوية على كتلة حرارية لمدة خمس دقائق. أضف المخزن المؤقت لتحميل هلام SDS إلى حصة من الكسور المسلوقة القابلة للذوبان وغير القابلة للذوبان MP40.

قم بتحميل كميات متساوية من العينات التي تم جمعها من جميع النقاط الزمنية على جل SDS-PAGE. اكتشف MP40 القابل للذوبان و SDS Atxn1 82Q GFP بواسطة اللطخة الغربية باستخدام الجسم المضاد المضاد ل GFP والتلألؤ الكيميائي المعزز. لفحص Atxn1 82Q المقاوم ل SDS من جزء الحبيبات باستخدام مقايسة تأخر المرشح ، قم بإعداد جهاز مؤامرة نقطية يحمل غشاء أسيتات السليلوز 0.2 ميكرون.

ثم قم بتحميل 80 إلى 120 ميكرولترا من عينات MP40 المسلوقة غير القابلة للذوبان في كل بئر من جهاز اللطخة النقطية. بعد تصفية العينات من خلال الغشاء عن طريق الفراغ ، اكتشف مجاميع Atxn1 82Q GFP العالقة على الغشاء عن طريق النشاف المناعي المضاد ل GFP. من الأهمية بمكان استخدام مقايسة تأخر المرشح لفحص مستويات الشكل المقاوم ل SDS بمرور الوقت.

وذلك لأن الشكل القابل للذوبان في SDS قد يتحول إلى شكل مقاوم ل SDS بدلا من أن يتحلل. في هذا المثال ، يكون الشكل المقاوم ل SDS ضئيلا ويظل مستوى مشابها على تجربة المطاردة. لإجراء فحص التحلل ، بعد تعداء ليلة واحدة لخلايا HeLa باستخدام NLS-luciferase-GFP ، افحص الخلايا الحية تحت مجهر فلوري مقلوب للتعبير عن GFP بطول موجة إثارة يتراوح من 450 إلى 490 نانومتر.

قبل العلاج ب cycloheximide مباشرة ، قم بحصاد صفيحة واحدة من الخلايا عن طريق إزالة الوسط واستخدم ثلاثة ملليلتر من PBS المثلج لغسل الخلايا مرتين. ثم قم بتجميد الطبق على الثلج الجاف. بالنسبة للألواح المتبقية ، بعد إزالة الوسط ، أضف ملليلترين من DMEM الطازج الذي يحتوي على 50 ميكروغراما لكل ملليلتر من سيكلوهيكسيميد وأضف 10 ميكرومولار من مثبط البروتيازوم MG132 إلى طبق واحد.

عالج الخلايا لمدة 1.5 وثلاث و4.5 وست ساعات قبل الحصاد كما هو موضح للتو ، وحصاد الخلايا المعالجة MG132 في ست ساعات. بعد حصاد آخر نقطة زمنية للخلايا ، اكشط كل طبق إلى 150 ميكرولتر من محلول تحلل الخلايا الباردة المثلجة واحتضنه على الجليد لمدة 30 دقيقة. احتضان العينات على كتلة حرارية عند 95 درجة مئوية لمدة خمس دقائق ، قبل إجراء SDS-PAGE والنشاف الغربي وفقا لبروتوكول النص.

أضف المخزن المؤقت لتحميل هلام SDS إلى محللات الخلية بأكملها للحصول على تركيز نهائي يبلغ 2٪ SDS و 50 مللي مولار DTT. بعد البذر ونقل خلايا HeLa في 96 لوحة بئر وفقا لبروتوكول النص ، بعد 20 إلى 24 ساعة من التعداء ، افحص الخلايا بحثا عن تعبير GFP. قم بإزالة الوسيط ، وأضف ما يقرب من 200 ميكرولتر من 1x PBS إلى كل بئر ثم استنشقه لإزالة DMEM المتبقي.

أضف 60 ميكرولترا من DMEM المنخفض الفلورة مع 5٪ FBS و 50 ميكروغرام لكل ملليلتر من cycloheximide وأضف 10 ميكرومولار MG132 إلى مجموعة واحدة من العينات. باستخدام قارئ لوحة التألق ، قم بقياس إشارة GFP ، وقراءة اللوحات كل ساعة لمدة تصل إلى ثماني إلى 10 ساعات. تصدير البيانات وإجراء التحليل الإحصائي وفقا لبروتوكول النص.

في تحليل الحالة المستقرة ، يمكن ملاحظة المجاميع النووية Atxn1 82Q GFP المرئية مجهريا في 30 إلى 50٪ من خلايا HeLa بعد 20 ساعة من التعداد. كما هو موضح هنا بواسطة اللطخة الغربية ، فإن عمر النصف ل Atxn1 82Q GFP في الجزء القابل للذوبان SDS هو حوالي خمس ساعات. على عكس انخفاض طفيف أو معدوم في Atxn1 82Q GFP في الجزء القابل للذوبان MP40 على مدار 16 ساعة.

تثبيط تدهور Atxn1 82Q GFP جزئيا عن طريق معالجة الخلايا ب MG132. توضح هذه الصور أنه بعد 20 ساعة من التعدي ، تصبح مجاميع GFP الطافرة NLS-luciferase DM مرئية مجهريا في خمسة إلى 15٪ من خلايا HeLa. كشفت البقع الغربية أن عمر النصف ل SDS القابل للذوبان NLS-luciferase DM GFP هو ساعتين إلى ثلاث ساعات.

بالإضافة إلى ذلك ، تقل شدة الإزهار للخلايا المنقولة أيضا بمرور الوقت عند العلاج بالسيكلوهكسيميد. بعد حوالي ست ساعات من المعالجة ب cycloheximide ، يتحلل GFP المتحور القابل للذوبان NLS-luciferase DM إلى حد كبير مما يشير إلى أن التألق المتبقي يتولد من الأنواع المجمعة المقاومة للتحلل. تؤكد صور الإزهار هذه أن GFP المجمعة ، ولكن غير المنتشرة ، تبقى في الخلايا بعد تسع ساعات من العلاج بالسيكلوهكسيميد.

حسنا ، يستغرق الفحص القائم على النشاف المناعي بضعة أيام حتى ينجز. يمكن الحصول على معدلات تحلل البروتين مباشرة بعد مطاردة cycloheximide باستخدام اختبار قائم على الفلورة. يمكن تطبيق كل من المقايسات القائمة على النشاف المناعي والتألق على دراسات البروتينات الأخرى غير المطوية.

هذا الأخير مناسب أيضا للفحص عالي الإنتاجية لتحديد الجزيئات الكبيرة أو المركبات الصغيرة التي يمكن أن تعدل تدهور البروتينات غير المطوية. من المهم أن تتذكر أنه بالنسبة لبعض البروتينات غير المطوية مثل Atxn1 82Q ، لا يمكن قياس نصف العمر إلا من خلال تجزئة الخلايا والنشاف المناعي وذلك لأن الأنواع غير المطوية التي تتحلل بسرعة ليست سوى جزء صغير من تعبير Atxn1 82Q الكلي. للكشف عن آلية ضوابط جودة البروتين ، يجب أن تقترن فحوصات تحلل البروتين بتحليل مستويات الحالة المستقرة للمجاميع بالإضافة إلى أنها أقسام في أجزاء مختلفة من الخلية.

يمكن أيضا إجراء تجارب أخرى مثل فحوصات طي البروتين وتجميعه في المختبر. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية قياس معدلات تحلل البروتينات الخاطئة باستخدام استراتيجيات مختلفة. شكرا على المشاهدة ونتمنى لك السعادة في تجاربك.