دراسة دور السنخية الضامة في سرطان الثدي ورم خبيث

هنا نصف النموذج والنهج لدراسة وظائف البلاعم السنخية الرئوية في ورم خبيث سرطاني. لإثبات دور هذه الخلايا في ورم خبيث ، تم استخدام النموذج المتزاوي (4T1) لسرطان الثدي بالتزامن مع استنفاد البلاعم السنخية مع الجسيمات الشحمية كلودرونات

الهدف العام من هذه التجارب هو تحديد دور البلاعم السنخية الرئوية في ورم خبيث سرطاني باستخدام نموذج متزامن لسرطان الثدي. يمكن لهذه الطريقة الإجابة على بعض الأسئلة الرئيسية في مناعة الورم ومجالات ورم خبيث للسرطان ، مثل سبب كون الرئتين واحدة من أكثر الأهداف شيوعا هي ورم خبيث للسرطان الممرض. الميزة الرئيسية لهذه الطريقة هي أنها تستخدم نموذج سرطان الثدي الراسخ للغاية مع طريقة محددة للغاية للميكروفاج السنخية الرئوية.

ستظهر هذا الإجراء سوريا كوماري فادريفو ، باحثة مشاركة في مختبري. في يوم حقن الخلايا السرطانية ، ضع أولا فأرا محلوقا ومخدرا على وسادة جراحية. بعد ذلك ، قم باستنشاق مرة واحدة من 10 إلى الخلايا السرطانية الخامسة في 100 ميكرولتر من PBS في حقنة أنسولين من نقطة صفر خمسة مليلتر مزودة بإبرة قياس 29.

ثم استخدمي الإبهام والسبابة لرفع الجلد بالقرب من الحلمة الثانية والثالثة، وأدخل الإبرة تحت الجلد في وسادة الدهون الثديية أسفل الحلمة الثالثة مباشرة. قم بحقن الخلايا ببطء تحت الجلد لتشكيل فقاعة تحت الجلد ، وأعد إلى قفصه مع المراقبة حتى يتعافى تماما. بعد أربعة إلى خمسة أيام من التلقيح ، لقياس الأورام ، قم بمسح موقع الورم واستخدام الفرجار لاستخدام كل من الأقطار الأكبر والأصغر للأورام لتحديد حجم الورم.

لتصوير خلايا 41GFP المحقونة ، ضع الفأر المخدر على مرحلة متحركة داخل جهاز التصوير ، وقم بتصوير موقع الورم عن طريق المجهر الفلوري. في خزانة السلامة الحيوية لتدفق الهواء ، بعد ستة أيام من حقن الخلايا السرطانية ، قم بتدوير الجسيمات الشحمية لتوزيع الجسيمات بالتساوي ، وشفط 60 ميكرولترا من المعلق في طرف ماصة معقمة. ضع الطرف بالقرب من فتحة أنف المخدر الملقح بالورم ، وحرر ببطء خمسة ميكرولترات من محلول الجسيم الشحمي ، مما يسمح للفأر باستنشاق القطرة.

من الأهمية بمكان إعطاء محلول الجسيمات الشحمية ببطء مع الحفاظ على المستوى المناسب من التخدير للسماح للحيوان بالتنفس بانتظام أثناء الولادة. عندما يتم إعطاء 60 ميكرولترا بالكامل ، اسمح للفأر بالتعافي تماما ، وأعد إلى قفصه. لحساب النقائل السطحية وتسجيلها ، ضع الرئتين تحت مجهر التشريح وركز الهدف حتى يتم الحصول على رؤية واضحة لسطح الرئة.

ثم قم بحساب الميتاسيس يدويا على الجانبين الأمامي والخلفي لكلتا الرئتين ، وقم بتصوير الأورام عن طريق الفحص المجهري الفلوري. بعد عد النقائل وتصويرها ، استخدم المقص الجراحي والملقط لفرم الرئة ونقل قطع الأنسجة إلى أنبوب مخروطي 15 مليلتر يحتوي على ثلاثة ملليلتر من عازلة الهضم. اختبر الصبغة الشظايا على شاكر دوار في حاضنة 37 درجة مئوية لمدة 40 دقيقة ، ثم قم بتقطيع الملاط لفصل الأنسجة.

بعد ذلك ، قم بتصفية تعليق الأنسجة من خلال مصفاة 40 ميكرون لإزالة أي كتل ، واضغط على القطع الكبيرة من خلال المصفاة باستخدام مكبس حقنة حسب الضرورة. عندما يتم تحقيق تعليق أحادي الخلية ، اجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي وقم بتحلل خلايا الدم الحمراء باستخدام عازلة ACK لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. ثم اغسل الحبيبات مرتين في ثمانية ملليلتر من RPMI.

بعد الطرد المركزي الثاني ، نعلق الخلايا في ثلاثة ملليلتر من وسط RPMI الكامل للعد ، وندور الخلايا مرة أخرى. الآن قم بتخفيف الخلايا إلى 1 في 10 إلى الخلايا السادسة لكل 100 ميكرولتر من تركيز المخزن المؤقت للفاكس ، ونقل 100 ميكرولتر من الخلايا إلى آبار فردية من صفيحة V-bottom ، 96 بئر. اجمع الخلايا الموجودة في قاع الآبار عن طريق الطرد المركزي ، ثم اقلب اللوحة للسماح للمخزن المؤقت بالتصريف.

قم بسد الخلايا ب 100 ميكرولتر من كتلة CD16 CD32 FC لمدة 15 دقيقة عند أربع درجات مئوية ، وقم بتثبيت اللوحة مرة أخرى. ثم اقلب اللوحة لإزالة المادة الطافية ، كما هو موضح للتو ، وأضف كوكتيل الأجسام المضادة ذات الأهمية إلى الآبار المناسبة. بعد 30 دقيقة عند أربع درجات مئوية ، قم بتقطيع الخلايا عن طريق الطرد المركزي ، متبوعا بغسل 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت للفاكس.

ثم أعد تعليق الكريات في 200 ميكرولتر من PBS الطازج وصمة لطيخ العينات بصبغة قابلة للحياة لمدة 20 دقيقة عند أربع درجات مئوية. في نهاية الحضانة ، اغسل الخلايا في 200 ميكرولتر أخرى من PBS ، وقم بإصلاح العينات في 100 ميكرولتر من واحد بالمائة بارافورمالدهيد للتخزين عند أربع درجات مئوية. مباشرة قبل تحليلها ، انقل معلقات الخلية إلى أنابيب قياس تدفق البولي بروبيلين.

حقن الخلايا السرطانية 4T1GFP في وسادة الدهون الثديية إلى تكوين أورام الفئران التي تلخص الانتشار النقيلي لسرطان الثدي البشري ، كما يتضح من النقائل سريعة التشكل التي لوحظت داخل الرئتين. يسهل التعدي المستقر لخلايا 4T1 مع GFP تتبع الخلايا السرطانية المنتشرة وتحديد العبء النقيلي. يوفر علم الأنسجة الروتيني ، جنبا إلى جنب مع خوارزميات علم الأمراض الرقمية ، أداة جيدة لقياس النقائل والتحقق منها.

علاوة على ذلك ، يسمح التحليل الحلقي متعدد الألوان بتوصيف مجموعات الخلايا النادرة ، مثل البلاعم السنخية الإيجابية CD11b و CD11c F80. يمكن تأكيد استنفاد ثنائي اللوترينات من خلال عدم وجود هذه الخلايا الإيجابية CD11c F480 في الرئتين المنفصلة للحيوانات المعالجة بالليبوسوم. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية حقن الخلايا السرطانية في وسادة الدهون الثديية ، ومراقبة نمو الورم والورم الخبيث ، واستنفاد البلاعم السنخية ، وإعداد خلايا الرئة لتحليل التدفق الحلقي.