دوامة العقدة العصبية يزدرع الثقافة والكهربية على موضوع الكهربائي صفائف

نقدم بروتوكولا لزراعة الخلايا العصبية العقدية الحلزونية الأولية للفئران على مصفوفات متعددة الأقطاب الكهربائية لدراسة ملامح الاستجابة العصبية وتحسين معلمات التحفيز. تهدف هذه الدراسات إلى تحسين واجهة الخلايا العصبية والقطب الكهربائي لغرسات القوقعة الصناعية لإفادة السمع لدى المرضى وكذلك استهلاك الطاقة للجهاز.

الهدف العام من هذا الإجراء هو توضيح كيفية زراعة وتسجيل النشاط الفيزيولوجي الكهربي للخلايا العصبية السمعية على مصفوفات متعددة الأقطاب الكهربائية. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال أبحاث السمع ، مثل توصيف الخاصية الفيزيولوجية الكهربية للخلايا العصبية السمعية والتحفيز بواسطة مناطق القطب. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تسمح بالتسجيل المتزامن خارج الخلية غير الغازية للنشاط العصبي لعدد كبير من الخلايا العصبية السمعية.

تمتد الآثار المترتبة على هذه التقنية إلى العلاج. في الواقع ، يمكن استخدامها لتنفيذ واجهة الخلايا العصبية الكهربائية للأطراف الاصطناعية مثل غرسة القوقعة الصناعية لاستعادة السمع لدى المرضى الصم. لبدء هذا الإجراء ، قم بإعداد محلول طلاء ECM عن طريق إذابة مزيج ECM أولا على الثلج.

ثم قم بتخفيف مزيج ECM في وسط الاستزراع الأساسي بنسبة واحد إلى 10 ، وقم بتخزينه على الثلج. بالنسبة للدول المتعددة الأطراف الجديدة في غطاء التدفق الرقائقي ، اغمرها في 70٪ من الإيثانول لمدة 30 ثانية. بعد ذلك ، اغسلها بالماء المقطر لمدة 30 ثانية.

ثم اترك MEAs يجف لمدة 30 دقيقة. لتغطية الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف، قم بتعبئة 50 ميكرولترا من محلول الطلاء فوق الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف بطرف ماصة بارد سعة 200 ميكرولتر. ثم اسمح للاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف بالذهاب لمدة 30 دقيقة إلى ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة.

بعد ذلك ، قم بإزالة محلول الطلاء. أضف 100 ميكرولتر من وسط الاستزراع المكملة ب 10٪ FBS وخمسة نانوغرام لكل مليلتر BDNF واتركه في درجة حرارة الغرفة حتى طلاء الأنسجة. بعد ذلك ، ضع طبق بتري الذي يحتوي على MEAs المطلي في طبق بتري كبير وأضف طبق بتري صغير يحتوي على PBS للترطيب.

في هذا الإجراء ، قم بتعقيم رأس الجرو بنسبة 70٪ من الإيثانول. ثم قطع الاتصال بين الجلد والجمجمة على طول الخط السهمي. بعد ذلك ، قم بقص الجمجمة بخامة وإزالة الدماغ.

بعد ذلك ، قم بقطع العظام الصدغية من الجمجمة وضعها في طبق بتري يحتوي على HBSS معقم مثلج. تحت مجهر التشريح ، قم بتشريح الفقاهة الطبلية باستخدام زوج من الملقط الدقيق وعزل الأذن الداخلية. ثم قم بإزالة عظم القوقعة.

بعد ذلك ، قم بإزالة الرباط الحلزوني و SV معا عن طريق إمساك الجزء القاعدي من العقدة الحلزونية و SV بالملقط وفك SV ببطء من القاعدة إلى القمة. افصل عضو كورتي عن العقدة الحلزونية في modiolus عن طريق إمساك الجزء القاعدي من العقدة الحلزونية وعضو كورتي بالملقط وفك عضو كورتي ببطء من القاعدة إلى القمة. بعد ذلك ، قم بقص الاستنتاجات الجانبية من العقدة الحلزونية باستخدام ملقط أو مقص أو سكاكين دقيقة للتشريح الدقيق.

الآن انقل النبتات العقدية الحلزونية وعضو كورتي إلى منطقة الشرق الأوسط وأفريقيا. بعد ذلك ، ضع مستخلصات SG فوق منطقة القطب الكهربائي وعضو كورتي على بعد خمسة ملليمترات تقريبا من منطقة القطب. ضع النباتات الخارجية وعضو كورتي على المجالات المتعددة الأطراف مع تجنب تلف الأنسجة.

بعد ذلك ، ضع MEAs بعناية في الحاضنة والثقافة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2. في اليوم التالي ، افحص النباتات الخارجية بصريا للتأكد من ارتباطها بالاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف. ثم أضف 100 ميكرولتر من وسط الاستزراع الذي يحتوي على 10٪ FBS و BDNF يوميا لمدة خمسة أيام متتالية.

في اليوم السادس ، أضف ملليلترين من وسط المزرعة الذي يحتوي على 10٪ FBS وخمسة نانوجرام لكل مليلتر BDNF وزرع الأنسجة لمدة 13 يوما إضافية. بعد 18 يوما من الثقافة الجماعية ، اغسل مزرعة MEA بالمحلول خارج الخلية الذي تم تحضيره مسبقا في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، جفف جهات اتصال شريحة MEA بقطعة من الأنسجة وقم بتركيب MEAs على حامل MEA.

أخيرا ، قم بتثبيت MEA على إعداد التسجيل. بعد ذلك ، أضف 300 ميكرولتر من المحلول خارج الخلية وانتظر لمدة 10 دقائق للسماح للنظام بالاستقرار قبل التسجيل. الآن ، سجل النشاط التلقائي لمدة دقيقتين من جميع الأقطاب الكهربائية وحدد الأقطاب الكهربائية النشطة.

بعد ذلك ، حدد الأقطاب الكهربائية التي تستجيب للتحفيز. لاستبعاد قطعة أثرية التحفيز ، قم بالتحفيز من نفس القطب 10 مرات. إذا استجابت المزرعة ثماني مرات على الأقل من أصل 10 مرات ، فيمكن افتراضها كاستجابة إيجابية عند التحفيز الناجم عن القطب.

لتحديد ضوضاء الخلفية ، قم بتطبيق TTX على الثقافة بتركيز ميكرومولار واحد لمنع قنوات الصوديوم ذات الجهد المسور ثم قم بالتسجيل لمدة دقيقتين. فيما يلي آثار التسجيلات الأصلية لستة من أصل 63 قطبا كهربائيا تظهر نشاطا عفويا وهذه هي المخطط النقطي للأقطاب الكهربائية الستة بعد اكتشاف السنبل. يمثل كل شريط إمكانات عمل واحدة.

تتضمن هذه المخطط النقطي جميع الأقطاب الكهربائية النشطة. يتم تسجيل الأنشطة من 63 قطبا كهربائيا لمدة دقيقتين. يوضح هذا الشكل أنه تم استخدام حافز ثنائي الطور بمدة إجمالية تبلغ 80 ميكروثانية وسعة 80 ميكرو أمبير لتحفيز الثقافة من قطب كهربائي واحد.

يوضح هذا المثال التمثيلي لآثار البيانات الأولية إمكانات الفعل ، كل ذلك بدون استجابات بعد التحفيز. وها هي ثقافة العقدة الحلزونية في MEAs الملطخة بالمناعة للعلامة العصبية ، TUJ ، في نهاية التجربة لتصور التغطية العصبية لمنطقة القطب. يشار إلى القطب المستخدم للتحفيز باللون الأخضر ويشار إلى الأقطاب الكهربائية المستجيبة باللون الأحمر.

بمجرد إتقانها ، يمكن القيام بهذه التقنية في 50 دقيقة إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. على الرغم من أن هذه الطرق يمكن أن توفر نظرة ثاقبة على الفيزيولوجيا الكهربية للخلايا العصبية العقدية الحلزونية ، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضا على أنظمة أخرى مثل ثقافات الدماغ أو الحبل الشوكي. بعد التطوير ، تمهد هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال علوم المواد وتكنولوجيا النانو ، والتعديل السريع لسطح اللطخة لأقطاب تسجيل الخلايا العصبية وتحفيزها.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية زراعة وتسجيل النشاط الفيزيولوجي الكهربي ، من خلال ترتيب نثر الخلايا العصبية على مصفوفات متعددة الأقطاب الكهربائية.