قياس الأنفلونزا النورامينيداز تثبيط الجسم المضاد التتر من قبل انزيم مرتبط كتين الفحص

الهدف العام من اختبار الليكتين المرتبط بالإنزيم هو قياس عيار الأجسام المضادة الوظيفية ضد النورامينيداز ، وهو بروتين سكري على سطح فيروس الأنفلونزا. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة عن الأسئلة الرئيسية في مجال اللقاح ، مثل ، هل هناك استجابة للأجسام المضادة للنورامينيداز بعد التطعيم ضد الأنفلونزا أو العدوى؟ الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها توفر منصة عملية لقياس عيار تثبيط النورامينيداز في أعداد كبيرة من عينات المصل.

تستخدم فيروسات الإنفلونزا المعاد تشكيلها التي تحتوي على النورامينيداز المورد للاهتمام والهيماجلوتينين من النوع الفرعي H6 في ELLA. هذا يمنع تداخل الأجسام المضادة ضد الهيماجلوتينين في اللقاح أو الفيروس المعدي A المعدي. يتطلب العمل مع فيروسات الأنفلونزا H6 الحية المعاد تشكيلها تصريحا والتعامل معها في إطار الإجراءات المعززة للسلامة الأحيائية من المستوى 2.

يمكن استخدام فيروسات H6 المعاد تشكيلها التي تم تعطيلها كيميائيا في الفحص. يتم استخدام فيروس H6N2 المعطل في هذا العرض التوضيحي. قم بإعداد تخفيفات الفيروس في صفيحة 96 بئرا عن طريق توزيع 120 ميكرولترا من عينة مخففة في أعمدة من 1 إلى 11 من لوحة التخفيف.

إلى العمود 1 ، أضف 96 ميكرولترا إضافيا من مخفف العينة. قم بإذابة الثلج ثم دوامة قارورة الفيروس قبل إضافة 24 ميكرولترا منه إلى بئر في العمود 1. هذا يعطي تمييع 1:10 للفيروس.

قم بعمل تخفيفات تسلسلية مزدوجة للفيروس في مخفف العينة عن طريق نقل 120 ميكرولتر من بئر إلى آخر ، باستخدام أطراف ماصة نظيفة لكل تخفيف. بعد ذلك ، اغسل صفيحة مطلية بالفيتوين ثلاث مرات باستخدام PBS-T. ثم امسح كل طبق على منشفة ورقية ماصة لإزالة أي مخزن غسيل زائد.

أضف 50 ميكرولترا من عينة مخففة إلى كل بئر في الأعمدة من 1 إلى 11 من الصفيحة المطلية بالفيتوين. أضف 100 ميكرولتر من مخفف العينة إلى العمود 12 للتحكم السلبي. انقل 50 ميكرولترا من الفيروس المخفف من الأعمدة من 1 إلى 11 من لوحة التخفيف إلى آبار مكررة من الصفيحة المطلية بالفيتوين.

اضغط برفق للخلط. ثم قم بتغطية اللوحة بمادة مانعة للحرارة. ضع الطبق في حاضنة مرطبة على حرارة 37 درجة مئوية.

بعد 16 إلى 18 ساعة ، انقل اللوحة إلى المقعد وقم بإزالة مانع التسرب للوحة. اغسل الطبق ست مرات باستخدام PBS-T ، ثم اقلبها واتركها على مناشف ورقية ماصة للتأكد من إزالة كل السائل من الآبار. بعد ذلك ، أضف 100 ميكرولتر لكل بئر من محلول بيروكسيداز الفول السوداني agglutinin الحصان والفجل إلى جميع الآبار واحتضان الطبق لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة.

قبل أقل من 15 دقيقة من انتهاء الحضانة ، قم بإعداد محلول العيادات الخارجية. اغسل ألواح الاختبار ثلاث مرات لإزالة PNA-HRPO وجففها قبل إضافة 100 ميكرولتر من ركيزة العيادات الخارجية إلى كل بئر. احتضن الطبق في الظلام لمدة 10 دقائق بالضبط في درجة حرارة الغرفة.

أوقف التفاعل بإضافة 100 ميكرولتر لكل بئر من حمض الكبريتيك العادي. استخدم قارئ الألواح لقياس الكثافة البصرية ، أو OD ، عند 490 نانومتر لمدة 0.1 ثانية. بعد ذلك ، حدد تخفيف الفيروس الذي سيتم استخدامه في علم الأمصال كما هو موضح في بروتوكول النص وكذلك في قسم النتائج.

من الأهمية بمكان تحديد التخفيف ضمن النطاق الخطي لمنحنى معايرة الفيروس. نحن نفضل التخفيف الذي يعطي إشارة قريبة من الحد الأقصى بحيث يتم استخدام نطاق الفحص الكامل. يتم إجراء ELLA بعد تحديد تخفيف الفيروس اللازم للفحص.

للبدء ، قم بإعداد الكواشف والمواد الأولية كما هو موضح في بروتوكول النص. تسخين عينات المصل وتنشيطها في حمام مائي عند 56 درجة مئوية لمدة 45 إلى 60 دقيقة. قم بإذابة قارورة من الفيروس والدوامة وأعد تعليقها في عينة مخففة عند التخفيف الذي تم تحديده.

قم بإعداد ما لا يقل عن خمسة ملليلتر من الفيروس لكل لوحة فحص. احتفظ بالفيروس المخفف على الثلج حتى يتم غسل الأطباق وإضافة عينات المصل إلى الطبق. قم بإعداد تخفيفات عينات المصل وأي عناصر تحكم عن طريق عمل تخفيفات متسلسلة مزدوجة في صفيحة مستديرة القاع سعة 96 بئرا ، بدءا من تخفيف واحد من كل عشرة في مخفف العينة.

استخدم ماصة متعددة القنوات لنقل 50 ميكرولترا من كل عنصر تحكم في المصل أو تخفيف العينة من لوحة التخفيف إلى آبار مكررة من صفيحة مغسولة بالفيتوين. يجب إضافة تخفيفات العينة في الأعمدة من 2 إلى 11. أضف 50 ميكرولترا من الفيروس المخفف إلى جميع الآبار باستثناء التحكم السلبي في العمود 12.

أضف 50 ميكرولترا من عينة مخففة إلى الآبار في العمود 1 وأضف 100 ميكرولتر من مخفف العينة إلى العمود 12. قم بتغطية الآبار باستخدام مادة مانعة للتسرب ثم تخلط عن طريق النقر برفق على جوانب اللوحة أو وضعها على شاكر الألواح بسرعة معتدلة لمدة 10 ثوان. ضع الطبق في حاضنة رطبة على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 16 إلى 18 ساعة.

عند اكتمال الحضانة الليلية ، اغسل الطبق قبل إضافة PNA-HRPO وأكمل الفحص كما كان من قبل. اقرأ الكثافة الضوئية عند 490 نانومتر وتأكد من صحة نتائج الفحصة. حدد عيار نقطة النهاية 50٪ كما هو موضح في بروتوكول النص وقسم النتائج.

لتحديد تخفيف الفيروس الذي سيتم استخدامه في علم الأمصال ، يتم إنشاء رسم بياني يرسم قيمة OD عند 490 نانومتر عند كل تخفيف للفيروس. يشكل الحد الأقصى OD هضبة عند أدنى تخفيفات الفيروس. حدد تخفيف الفيروس الذي يعطي ما يقرب من 90٪ من الحد الأقصى للإشارة ويقع ضمن النطاق الخطي.

تأكد من أن OD عند التخفيف المحدد أكبر بعشرة أضعاف على الأقل من إشارة الخلفية. هذا هو تخفيف الفيروس المحدد ل ELLAs التي تستخدم مخزون الفيروسات المعين هذا. تظهر النتائج التمثيلية لمقايسة الليكتين المرتبط بالإنزيم التي توضح النسبة المئوية لتثبيط نشاط النورامينيداز الذي تم حسابه لكل تخفيف في المصل.

يتم رسم تخفيف المصل على مقياس لوغاريتمي كما هو موضح في هذا الرسم البياني. تحديد تخفيف المصل الذي أدى إلى تثبيط أكبر أو يساوي 50٪ من نشاط النورامينيداز. في هذا المثال ، أدى تخفيف المصل 1 في 160 إلى تثبيط بنسبة 74٪ ، وأدى تخفيف المصل 1 في 320 إلى تثبيط 45٪.

وبالتالي فإن عيار تثبيط النورامينيداز هو 160. بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين لاستكشاف الاختلافات المستضدية في النورامينيدات لفيروسات الأنفلونزا الموسمية. تم استخدام ELLA أيضا لإثبات أن الأجسام المضادة المثبطة للنورامينيداز ترتبط بالحماية من العلامات السريرية للأنفلونزا.