الفحص التدفق الخلوي استنادا لمراقبة وظائف الخلايا القاتلة الطبيعية

وصفت وهناك طريقة بسيطة وموثوق بها هنا لتحليل مجموعة من وظائف الخلايا القاتلة الطبيعية مثل تحبب، خلوى والإنتاج chemokine ضمن مختلف مجموعات فرعية الخلايا القاتلة الطبيعية.

الهدف العام من هذا الإجراء هو مراقبة وظائف الخلايا القاتلة الطبيعية باستخدام الفحص القائم على قياس التدفق الخلوي. تعتبر الخلايا القاتلة الطبيعية ضرورية لنتائج الالتهابات الفيروسية المختلفة والأمراض الخبيثة. لمراقبة وظائف الخلايا القاتلة الطبيعية بشكل أفضل ، طور مختبرنا اختبارا قائما على قياس التدفق الخلوي يمكن استخدامه في كل من البحث العلمي والتقييمات السريرية.

قمنا بتحسين البروتوكول للسماح بتحليل أحجام عينات الخلايا القاتلة الطبيعية الصغيرة وهو أمر ضروري لاستخدامه في طب الأطفال ومرضى نقص المناعة. ميزة إضافية لهذه التقنية هي إمكانية قياس وظائف الخلايا القاتلة الطبيعية ليس فقط داخل مجموعة الخلايا القاتلة الطبيعية بأكملها ، ولكن أيضا في مجموعات فرعية مختلفة من الخلايا القاتلة الطبيعية. لعزل الخلايا القاتلة الطبيعية ، ابدأ بخلط الحجم المناسب من محلول كوكتيل عزل الخلايا القاتلة الطبيعية مع ستة إلى 10 ملليلتر من الدم الكامل المحيطي EDTA من المريض عن طريق عدة انعكاسات.

بعد ذلك ، قم بمزيد من تجانس العينة على دوار الأنبوب لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. ثم ضع الأنبوب في فاصل مغناطيسي لمدة 15 دقيقة في ظل ظروف معقمة ، مع الحرص على أن يكون ملصق الأنبوب متجها نحو الجزء الخلفي من المغناطيس لتسهيل رؤية خط الفصل. في نهاية الفصل ، انقل المادة الطافية بعناية إلى أنبوب جديد سعة 15 مليلتر وارفع الحجم النهائي إلى 15 مل مع وسط كامل.

اغسل الخلايا عن طريق الطرد المركزي وأعد تعليق الحبيبات في مليلتر واحد من الوسط الكامل الطازج. ثم عد الخلايا واضبط الحجم على تركيز مرتين على الأقل 10 إلى الخلايا القاتلة الطبيعية الرابعة لكل 100 ميكرولتر في وسط كامل. لتحفيز الخلايا القاتلة الطبيعية المعزولة ، قم أولا بخلطها برفق عن طريق سحب العينات خمس مرات على الأقل وتناول 100 ميكرولتر من الخلايا في الآبار المناسبة لصفيحة ذات قاع V مكونة من 96 بئرا.

أطفئ الضوء وأضف الجسم المضاد المضاد ل CD107a إلى كل بئر من خلايا NK. ثم امزج بعناية كمية من الخلايا السرطانية K562 في اثنين في 10 إلى الخلايا الرابعة لكل حجم 100 ميكرولتر عن طريق سحب العينة خمس مرات على الأقل ونقل 100 ميكرولتر من الخلايا السرطانية إلى كل منها مخطط جيدا للتحفيز. تعتبر سحب العينات الدقيقة وإعداد نسبة مستجيب مستهدفة من واحد إلى واحد ذات أهمية رئيسية للتقييم الدقيق لوظيفة الخلايا القاتلة الطبيعية.

بعد ذلك ، أضف IL-2 و IL-15 إلى آبار التحفيز واخلط جميع الآبار عن طريق سحب العينات خمس مرات على الأقل. احتضان اللوحة المحمية من الضوء لمدة ثلاث ساعات عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. بعد الساعة الأولى مع إطفاء الضوء ، أضف محلول مثبط نقل البروتين الطازج إلى كل بئر مع الخلط الدقيق وأعد اللوحة إلى الحاضنة.

في نهاية الحضانة ، قم بخلط الثقافات المشتركة بعناية ونقلها إلى أنابيب قياس التدفق الخلوي المقابلة لها. أضف ملليلترا واحدا من المخزن المؤقت للغسيل إلى كل أنبوب للطرد المركزي وأعد تعليق الكريات في 99 ميكرولتر من PBS بالإضافة إلى ميكرولتر واحد من علامة الخلايا الميتة القابلة للإصلاح لكل عينة. امزج الخلايا عن طريق الدوامة ، متبوعا بحضانة لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام.

في نهاية الحضانة ، اغسل الخلايا في مليلتر واحد من عازلة الغسيل وأعد تعليق الكريات في 84 ميكرولتر من مخزن الغسيل بالإضافة إلى 16 ميكرولترا من كوكتيل الأجسام المضادة المناسب لسطح الخلية. امزج العينات عن طريق الدوامة واحتضانها لمدة 20 دقيقة في الظلام عند أربع درجات مئوية. ثم اغسل الخلايا في مليلتر واحد من محلول الغسيل وأعد تعليق الكريات في 100 ميكرولتر من محلول التثبيت البارد.

تخلط عن طريق الدوامة ، تليها 10 دقائق عند أربع درجات مئوية في الظلام. الآن اغسل الخلايا في مليلتر واحد من عازلة الغسيل وأعد تعليق الكريات في 90 ميكرولتر من المخزن المؤقت للنفاذية. صبغ ب 10 ميكرولتر من الأجسام المضادة المناسبة داخل الخلايا واخلطها عن طريق الدوامة.

بعد 30 دقيقة في الظلام عند أربع درجات مئوية ، اغسل الخلايا مرتين في مليلتر واحد من المخزن المؤقت للنفاذية الطازجة. ثم أعد تعليق العينات في 400 ميكرولتر من المخزن المؤقت للنفاذية الطازجة. تخلط جيدا عن طريق الدوامة وتوضع الخلايا على الجليد حتى تحليلها عن طريق قياس التدفق الخلوي.

أسرع وقت ممكن ، انقل جميع الأنابيب إلى مقياس التدفق الخلوي وابدأ في الحصول على البيانات. هنا ، يتم توضيح استراتيجيات البوابات لتحليل إزالة التحبيب وإنتاج السيتوكين والكيموكين لجميع خلايا القاتل القاتل الطبيعية بالإضافة إلى ثلاث مجموعات فرعية مختلفة من الخلايا القاتلة الطبيعية. لم تنتج الخلايا القاتلة الطبيعية غير المحفزة من متبرعين أصحاء إنترفيرون جاما ولا MIP-1 بيتا ولا تعبر عن CD107a على سطحها.

في المقابل ، أنتجت الخلايا القاتلة الطبيعية المحفزة بالخلايا السرطانية والسيتوكينات كميات كبيرة من إنترفيرون جاما داخل الخلايا و MIP-1 بيتا مع أكثر من 20٪ من الخلايا التي تظهر إزالة التحبيب عند تفاعل الخلايا السرطانية كما يتضح من تعبير سطح الخلية CD107a. بمجرد إتقانها ، يمكن إكمال هذه التقنية في ثماني ساعات. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تكون دقيقا في طلاء الخلايا القاتلة الطبيعية والخلايا السرطانية K562.

للحفاظ على نسبة المستجيب المستهدف المحددة ، يجب أن يكون العد دقيقا قدر الإمكان. يمكن تعديل هذا الإجراء المرن بسهولة. على سبيل المثال ، يمكن تحليل الخلايا القاتلة الطبيعية داخل مجموعة PBMC أو يمكن استخدام أجسام مضادة مختلفة للتحقق من وجود علامات أخرى ذات أهمية.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تنقية الخلايا القاتلة الطبيعية وتحفيزها وتسميتها لمراقبة وظيفتها باستخدام مقايسة قائمة على قياس التدفق الخلوي. لا تنس أن العمل مع الخلايا البشرية والمستهدفة يحتمل أن يكون خطيرا وأن احتياطات السلامة مثل ارتداء معدات الحماية الشخصية المناسبة يجب دائما اتخاذ أثناء تنفيذ هذا الإجراء.