تسجيل غاما التذبذبات الفرقة في Pedunculopontine نواة الخلايا العصبية

الهدف العام من هذا العرض التوضيحي هو وصف طريقة للكشف عن تذبذبات العتبة العالية والعتبة الفرعية في الخلايا العصبية pedunculopontine. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على أسئلة حول ، على سبيل المثال ، كيف تحافظ الخلايا على تردد إطلاق النار. كيف يحافظ السكان على وتيرة إطلاق النار؟

نحن نعلم أن الدوائر لا يمكنها الحفاظ على نطاق جاما أو تذبذبات من 40 إلى 60 في الثانية. لذلك ، فأنت بحاجة إلى خصائص غشاء جوهرية للحفاظ على هذا النوع من تردد إطلاق النار. ستظهر الإجراء سوزان ماهافي والدكتورة ستازيا دونوفريو.

لتحضير aCSF القياسي ، قم أولا بإعداد محاليل المرق A و B واحتفظ بها في الثلاجة عند أربع درجات مئوية لمدة تصل إلى أسبوعين. قبل كل تجربة ، اخلطي 50 مل من المرق أ مع 50 مل من المرق ب ، ثم أحضر الخليط إلى لتر واحد بالماء المقطر وأكسجه بالكربوجين في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة على الأقل. انقله إلى دورق للتحريك والأكسجين.

بعد الفقاعات ، أضف كلوريد الكالسيوم. بعد ذلك ، قم بإعداد السكروز aCSF عن طريق تحضير محلول المخزون C.قبل كل تجربة ، اخلطي 300 مل من المرق C مع 600 مل من الماء المقطر وأكسجته بالكربوجين في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة على الأقل. بعد ذلك ، انقل 100 مل من محلول السكروز aCSF إلى دورق نظيف ، وضعه على الثلج ، واحتفظ به مؤكسجا بالكربوجين.

الآن ، املأ حجرة قطع الاهتزاز بالسكروز aCSF واحتفظ بها مؤكسجة. قم بتشغيل نظام التبريد القائم على الجلسرين المقترن بغرفة التقطيع وانتظر 15 دقيقة للسماح له بالتبريد إلى حوالي أربع درجات مئوية. بعد ذلك ، قم بإزالة دماغ الجرو عن طريق وضع ملعقة تحت البصلة الشمية ودفعها برفق للخارج من المنطقة المنقارية باتجاه المنطقة الذيلية.

بعد ذلك ، ضع الدماغ في السكروز المؤكسج المثلج aCSF. قم بعمل قطع طفيلي على نصف الكرة الأيمن لإزالة ما يقرب من 1/3 من نصف الكرة الأرضية. ثم قم بلصق الجانب المشذب من الدماغ على القرص المعدني.

بعد ذلك ، قم بتثبيت القرص المعدني في غرفة القطع الاهتزازية وقم بتقطيع أقسام سهمية بحجم 400 ميكرون تحتوي على PPN. احتفظ بشرائح PPN في درجة حرارة الغرفة لمدة 45 دقيقة قبل تسجيل مشبك التصحيح للخلية بأكملها. في هذا الإجراء ، انقل شريحة إلى غرفة الغمر ، ضع حاجزا فوقها لتثبيت الشريحة لأسفل ، وقم بنقسها بسرعة 1.5 مل في الدقيقة باستخدام aCSF المؤكسج الذي يحتوي على مضاد المستقبل المحدد.

من أجل عزل خصائص الغشاء الجوهري ، ما عليك القيام به هو منع الانتقال المشبكي السريع حول الخلية وكذلك منع القدرة على توليد إمكانات الفعل ، لذلك عليك استخدام حاصرات متشابكة والسموم الرباعية ، أو TTX ، من أجل منع إمكانات العمل. بهذه الطريقة ، الخلية التي تقوم بترقيعها هي التي تولد هذه الخصائص ، ولا يوجد مدخل متشابك مسؤول عنها ، وهذا ما ندرسه هنا ، خاصية الغشاء الجوهري. بعد ذلك ، املأ ماصة تصحيح التسجيل بمحلول عالي البوتاسيوم داخل الخلايا.

أدخل الماصة في حامل الرأس. بعد ذلك ، قم بتطبيق ضغط إيجابي صغير باستخدام حقنة سعة مليلتر واحد متصلة بحامل الماصة. باستخدام هدف 4x جنبا إلى جنب مع بصريات تباين التداخل التفاضلي القريب من الأشعة تحت الحمراء ، حدد موقع نواة PPN ، وهي ظهرية للساق المخيخية العلوية.

اخفض ماصة التسجيل ببطء إلى نواة PPN باستخدام ميكرومانيبولاتر ميكانيكي. ثم ضع ماصة التسجيل في PPN pars compacta، والتي تقع مباشرة في الطرف الخلفي للسويقة. باستخدام عدسة غمر الماء 40x ، اجعل ماصة التسجيل ملامسة للخلايا العصبية PPN ، وقم بتطبيق الشفط السلبي بسرعة لتشكيل ختم مع الخلية.

استخدم برنامج ختم مشبك الجهد لمراقبة مقاومة الماصة أثناء الشفط السلبي. ثم قم بزيادة الضغط السلبي ببطء. عندما تصل قيمة مقاومة الماصة إلى 80 إلى 100 ميغا أوم، قم بتغيير إمكانات التثبيت بسرعة إلى 50 مللي فولت وحرر الضغط السلبي.

قم بتطبيق الضغط السلبي بشكل مستمر حتى يتمزق غشاء الخلية ويتم الوصول الكهربائي في تكوين البيع بالجملة. قبل الشفط ، تكون المقاومة منخفضة ، في هذه الحالة ، 2.5 ميغا أوم. عند تطبيق الشفط ، تقل سعة الخطوة نحو الإمساك.

عندما يتم تشكيل الختم ، لاحظ أن المقاومة تزداد إلى 167 ميغا أوم. مع شفط إضافي ، يتم تشكيل gigaseal. تزداد المقاومة لفترة وجيزة إلى 1.2 جيجا أوم قبل الحصول على وصول بالجملة.

راقب باستمرار إمكانات غشاء الراحة للخلايا العصبية PPN التي يتم تسجيلها. إذا تحولت إمكانات الغشاء المريح نحو قيم إزالة الاستقطاب أو فرط الاستقطاب ، فقم بتطبيق كمية صغيرة من التيار المباشر للحفاظ على الإمكانات المثلى عند 50 مللي فولت. السبب وراء استخدامنا للمنحدرات الحالية هو أن نتمكن من إزالة استقطاب الغشاء ببطء دون تنشيط قنوات البوتاسيوم التي تمنعك من إزالة استقطاب الغشاء بدرجة كافية للوصول إلى عتبة قنوات الكالسيوم عالية العتبة التي ندرسها.

تظهر هنا إمكانات الغشاء التمثيلية التي تستجيب للخطوات المربعة لإزالة الاستقطاب التي يبلغ طولها ثانيتان لزيادة التيار المحقون داخل الخلايا من خلال ماصة التسجيل في وجود حاصرات متشابكة و TTX. يوضح هذا الشكل طيف طاقة لتذبذبات الغشاء الناجمة عن الخطوات الحالية المشار إليها في ثلاثة تسجيلات. كانت جميع الترددات المستحثة منخفضة الطاقة ومنخفضة التردد.

يوضح هذا الشكل المنحدرات الحالية البالغة 200 و 400 و 700 بيكوأمبير واستجابات الغشاء. لاحظ أن الغشاء مزيل الاستقطاب بدرجة كافية ليصل إلى 30 مللي فولت ، حيث تبدأ قنوات الكالسيوم عالية العتبة في الفتح ، كما في التسجيل الأزرق ، ومستوى 10 مللي فولت الذي يكون فيه اتساع التذبذب أقصى قدر ، كما في التسجيل الأحمر. يوضح هذا الرسم البياني طيف القدرة لتذبذبات الغشاء الناجمة عن المنحدرات الحالية في التسجيلات الثلاثة المقابلة.

كانت الترددات الناتجة عن منحدر 400 بيكوأمبير في نطاق بيتا ، وبحلول منحدر 700 بيكوأمبير كانت في نطاق جاما. بمجرد إتقانها ، يمكن القيام بهذه التقنية في حوالي ساعة أو أقل. عند إجراء التسجيل ، من المهم حقا التأكد من أن لديك ختما محكما وأن لديك تعويض السعة ومقاومة السلسلة مراقبة جيدا للتأكد من عدم وجود تغييرات كبيرة أثناء إجراء التسجيل.

بمجرد عزل هذه التذبذبات ، ما يمكنك فعله هو اختبار تحديد ما إذا كانت تتوسط بالفعل قنوات الكالسيوم من النوع N أو P / Q. يمكنك استخدام conotoxin لمنع تذبذبات القناة من النوع N و agatoxin لمنع تذبذبات القناة من نوع P / Q. عندما طورنا هذه التقنية ، أصبح من الأسهل عليك إثبات أن قنوات الكالسيوم ذات العتبة العالية كانت تعتمد بالفعل على تذبذبات الغشاء الجوهرية ، وأصبح طفرة في مجال أبحاث النوم لتحديد أن نظام التنشيط الشبكي يمكن أن يولد بالفعل تذبذبات نطاق جاما من تلقاء نفسه.