Name: بناء نماذج العناصر المحدودة المعنية بالتحقيق في الزرد الفك الميكانيكا الحيوية (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 11 s
Description: اكتشف تحليل العناصر المحدودة لمحاكاة البيئة الميكانيكية لفك سمك الزرد النامي. تساعد هذه الطريقة الباحثين على دراسة تأثير الأحمال الميكانيكية على سلوك الخلايا والتعبير الجيني.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

وقد تم تمويل LHB من قبل برنامج الدكتوراه خلية يلكوم ترست الحيوي. وقد تم تمويل كار عن طريق منحة المشروع MRC MR / L002566 / 1 (تمنح للEJR وCLH)، والممول من قبل الوامق ARUK منحة 19479. كما نود أن نشكر منشأة وولفسون Bioimaging للحصول على المشورة التصوير.

كل الخطوات ضمن بروتوكول تتبع جامعة بريستول رعاية الحيوان والمبادئ التوجيهية الرعاية الاجتماعية وتلك من وزارة الداخلية في المملكة المتحدة. 1. التصور العضلية الهيكلية التشريح ملاحظة: لتصور شكل من العناصر الهيكلية، لتحديد العضلات وتحديد وضع المحدد من المرفقات العضلات، immunostain (القسم 1.1) الأسماك في العمر المناسب للميوسين الهيكل العظمي (الذي يكشف العضلات) والنوع الثاني الكولاجين (لتصور غضروف). بدلا من ذلك، تصور تشريح العضلات والعظام باستخدام خطوط مراسل الفلورسنت المعدلة وراثيا مثل الكولاجين مراسل A1 col2a1: mCherry 13،14 لتصور الغضروف وبطيئة الميوسين السلسلة الثقيلة مراسل smyhc: GFP 15 إلى تصور موقف إرفاق ملفات العضلات (القسم 1.2). خطوط بديلة بمناسبة الغضاريف والعضلات يمكن أن تعمل جيد على قدم المساواة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نيون Immunostaining <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إصلاح يرقة في زيادة 4٪ بارافورمالدهيد (PFA) في الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) لمدة 1 ساعة. يغسل في برنامج تلفزيوني مع 0.1٪ توين 20 (PBT) ويذوى في 50٪ الميثانول (MeOH) في PBT و 100٪ MeOH لمدة 5 دقائق على التوالي. تحذير: PFA غير سامة، ويجب أن يتم التعامل معها وفقا لصحيفة سلامة المواد. ملاحظة: يمكن تخزين اليرقة في 100٪ MeOH حتى المطلوبة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ترطيب يرقة في 50٪ MeOH في PBT لمدة 5 دقائق. يغسل في PBT لمدة 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Permeabilize يرقة في التربسين 0.25٪ في PBT على الجليد لمدة 5-6 دقيقة. يغسل في 4X PBT لمدة 5 دقائق لكل منهما. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> منع لمدة 2-3 ساعة في 5٪ مصل في PBT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان اليرقة في التخفيف الموصى بها من أرنب المضادة من نوع 2 الكولاجين والفأر الأجسام المضادة المقاومة للميوسين في 5٪ مصل في PBT لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة أو بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. ملاحظة: مجموعة التخفيف الموصى به هو عادة على ورقة بيانات الأجسام المضادة. اختيار الأجسام المضادة التي تثار ضد الأنواع المختلفة لبعضها البعض، والتي هي أيضا زراعية مختلفةالإيجار إلى الأنسجة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل 6X اليرقة لمدة 15 دقائق في PBT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> منع لمدة 1-2 ساعة في 5٪ مصل في PBT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان في الأجسام المضادة الثانوية في الظلام. استخدام fluorescently المسمى مكافحة فأر (550) والمضادة للأرنب (488) الأجسام المضادة الثانوية في التخفيف المناسبة في 5٪ مصل وPBT لالأجسام المضادة المحددة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل 6X لمدة 10 دقائق في كل PBT وصورة على مبائر المجهر 10X في أقرب وقت ممكن. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التصوير العضلية الهيكلية الهندسة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جبل اليرقات البطني على ساترة في الفاتر منخفض الاغاروز 0.3-0.5٪ نقطة انصهار (آخر دورة شهرية) في حل Danieau في 16. ملاحظة: الأسماك المعدلة وراثيا ستكون هناك حاجة إلى تخدير في 0.02٪ MS222 (تريكين methanesulfonate، ودرجة الحموضة 7) قبل التركيب وأثناء التصوير. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خذ كومة صورة متحد البؤر في المنطقة ذات الاهتمام باستخدام عدسة الهدف 10X وتقريب رقمي 2.5x و تقريبا. إعداد الصور للقناة الخضراء والحمراء باستخدام نانومتر 488 و 561 نم يزر على التوالي. صورة في بكسل القرار 512 × 512 مع فاصل زمني بين الطائرات ض من 1.3 ميكرون و 3 متوسطات خط. وسيضم كومة مما أدى ما يقرب من 100 شرائح ض. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تصدير البيانات على شكل سلسلة شجار. وتظهر التوقعات إلى أقصى حد من العضلات والغضاريف عناصر من اليرقة الزرد 5dpf في الشكل 1. </li></ol></li></ol> 2. توليد سطح 3D <ol style="margin-left: 40px;;text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختيار مجموعة بيانات تمثيلية لكل نقطة زمنية في 3 و 4 و 5 DPF (اختر بعد التصور من عينات متعددة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فتح 3-الأبعاد كومة شجار وتحديد كافة القنوات في برامج التحليل. انقر بزر الماوس الأيمن على قناة الغضروف واختر صورة مرشح وتمهيد: جاوس (الشكل 2B). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في ضوء مشروع حق انقر على الصورة التي تمت تصفيتها واختر &#39;تقطيع الصورة&#39; ثم &#39;تعديل تسمية جديدة &quot;. إنشاء تسمية جديدة لكل مادة، أي الغضروف ويoint. حدد منطقة غضروف الصورة (الشكل 2C، إشارة البيضاء، الخطوط العريضة الأرجواني) باستخدام أداة العصا السحرية. استخدام أداة فرشاة لإزالة الضجيج من الخطوط. ملاحظة: إذا كنت تستخدم أداة العصا السحرية، انقر فوق &quot;جميع شرائح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حدد منطقة مشتركة مع أداة الفرشاة وتعيين إلى مكون مشترك (الشكل 2C، المخطط الأزرق) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شرائح متعددة ناعمة في آن واحد عن طريق تحديد تجزئة في القائمة العلوية والعلامات على نحو سلس. انقر بزر الماوس الأيمن على الصورة واختر توليد سطح لإنتاج سطح 3D تجعل من المكون (الشكل 2D). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انقر على السطح وحفظ البيانات كملف hmascii للاستيراد إلى برنامج الربط. </li></ol> 3. حساب القوات العضلات لاستخدامه في FE نموذج <ol style="margin-left: 40px;;text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حساب عدد الألياف العضلية من الصور مبائر من smyhc: GFP الزرد المعدلة وراثيا (الشكل 1A، رأس السهم، 1C) وقياس بقطرالعطر من الألياف لحساب مساحة المقطع صليبهم (πr 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد القوة المناسبة لكل وحدة مساحة العضلات من الأدب. واستخدمت القوة العضلية القصوى ولدت في وحدة المساحة للعضلات الهيكل العظمي الزرد اليرقات (40 ن ن / ميكرون 2) 17. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حساب القوى من أجل كل مجموعة العضلات التشريحية بضرب عدد من الألياف ومنطقتهم من قبل القوة في وحدة المساحة. انظر الجدول 1. </li></ol> 4. توليد لشبكة <ol style="margin-left: 40px;;text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استيراد نموذج 3D ولدت في القسم 2 (أعلاه) إلى مجموعة من البرامج قادرة على توليد شبكة العناصر المحدودة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> توليد A2D شبكة من الغضروف والسطوح المشتركة باستخدام أداة يتقلص التفاف ضمن القائمة 2D. اختر حجم العنصر المناسب. ملاحظة: استخدام حجم عنصر بين 1.5-2.5. إذا لزم الأمر، وتوليد مجموعة من سطح 2D الحجم بشكل مختلف الحديدية لتنفيذ 3D شبكة الأمثل (القسم 4.4). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> القيام بعمليات تفتيش جودة شبكة وجدت تحت &quot;2D&gt; أدوات&gt; تحقق عناصر&quot; لوحة للتحقق من العناصر المكررة، الإدراج والاختراقات في شبكة. إصلاح زاوية زوجية باستخدام علامة التبويب فائدة في شجرة النموذج. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> توليد شبكة 3D من تنسجم سطح 2D من اختلاف حجم عنصر باستخدام subpanel 3D&gt; Tetramesh. ملاحظة: مقارنة نتائج أحجام شبكة مختلفة، واختيار النموذج FE بأقل حجم شبكة أن يتقاطع بعد مزيد من عمليات المحاكاة ولا تساوم تعريف الميزة. على سبيل المثال في الشكل (3) يحتوي على 1.5 مليون العناصر رباعي السطوح لغضاريف الفك السفلي، وكان حجم عنصر 2D من 2.0. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحويل شبكة بذلك نموذج الفك على نطاق وفقا كومة متحد البؤر باستخدام الهندسة&gt; بعد subpanel. ملاحظة: تأكد من الغضروف وترتبط مكونات مشتركة في النموذج من خلال تصدير نموذج المدمجة أو باستخدام العلاقات بين البلدين. </li></ol> 5. عنصر محدود وزارة الدفاعالبناء ايل <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام البرمجيات التجارية العناصر المحدودة (FE)، خلق نموذج FE. باستخدام العضلات والغضاريف 3D المسمى مداخن متحد البؤر ولدت في القسم 1 كدليل، تعيين العقد التي تتوافق مع نقاط التعلق العضلات. إنشاء ناقلات بين عقدتين تمثل الأصل والإدراج من كل العضلات (الشكل 3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إنشاء جامع شحنة من &quot;التاريخ&quot; نوع لتطبيق &quot;تحميل C&quot; لكل عضلة. تحديد الحجم في نيوتن (المحسوبة في الخطوة 3.3) وتعيين ناقلات المرتبطة بها. ويبين الشكل 3 نقاط مرفق للفك السفلي المقرب (AM)، منقلة اللامي (PH) وintermandibularis (IM). ملاحظة: للحصول على هذه عضلات الفك، يتم توزيع أقصى قوة مقلص بين الأصل والإدراج بحيث يتم تطبيق 50٪ فقط من كل حمولة في كل موقع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعيين خصائص المواد الخواص المرنة المناسبة على النحو الذي تحدده الأدب. معامل يونغ لغضروفوكانت interzone في هذا النموذج 1.1 ميجا باسكال و 0.25 ميجا باسكال على التوالي وكان نسبة بواسون 0.25 لكل من 18،19. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إنشاء جامع حمولة من نوع &quot;الحدود&quot; لتطبيق القيود الأولية على النموذج. انتقل إلى علامة التبويب تحليل&gt; القيود وفي خلق subpanel، واختيار العقد على النموذج الذي ترغب في تقييد. حدد درجات الحرية (DOF) أن حركة الحد من النموذج إلى أفضل تقريب نطاقها الطبيعي للحركة. ملاحظة: تم تقييد هذا النموذج في الشكل (3) في جميع محاور الحركة (DOF: 1، 2، 3 تمثل س، ص و z على التوالي) في قرني لامي لتثبيته في الفضاء في منتصف نقطة في نموذج وفي محور y و ض عند النقطة التي تربط palatoquadrate إلى بقية الجمجمة الزرد (الشكل 3، الجدول 1). يجب أن تكون مقيدة نموذج في كل شعبة الشؤون المالية الثلاث في أقل عقدة واحدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إنشاء &quot;تحميل خطوة، لكل نوع من أنواع الحركة التي ترغب في simulأكل (أي فتح، إغلاق)، ضمن القائمة تحليل وتحديد كافة الأحمال ذات الصلة (صنع في القسم 5.2) والقيود (صنع في القسم 5.4) لمحاكاة هذه الحركة. اختر &#39;ثابت&#39; من القائمة المنسدلة عند ظهوره. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نموذج التصدير بما في ذلك شبكة، والأحمال والقيود وخصائص المواد في تنسيق الملف المناسب، في شكل هذه القضية &quot;.inp&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نموذج الحمل في برامج التحليل FE. إنشاء وتنفيذ وظيفة للنموذج باستخدام وحدة العمل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحليل الناتج عن الإجهاد، والتوتر، والتشريد، وما إلى ذلك وجدت في نتائج التبويب والقائمة التصور (الشكل 4 و 5). </li></ol> 6. التحقق من الفك التشوه / المهجرين المسافات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حدد 3-6 تيراغرام (Col2a1aBAC: mcherry) الزرد المعدلة وراثيا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بخفة تخدير اليرقات مع 0.02٪ MS222 حتى انتهوا إلى الاستجابة للمس ولكن قلوبهم لا تزال الضرب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جبلاليرقات أفقيا (في حين مخدرة) coverslips على في الفاتر 1٪ من آخر دورة شهرية الاغاروز (تتكون في حل Danieau ل). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الاغاروز من حول الرأس والفك مع ملقط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> طرد حل جديد Danieau ل(مع عدم وجود MS222) على رأس اليرقة لإزالة التخدير باستخدام ماصة باستور حتى تستأنف حركات الفم العادية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام الفيلم التقاط برامج لاتخاذ مشرق الميدان عالية السرعة الفيديو من حركات الفم. خذ الأفلام من حول مدة دقيقة على أعلى معدل الإطار، أو كافية لتسجيل دورات متعددة من فتح الفك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختيار الإطارات التي تظهر الفك مفتوحة إلى أقصى النزوح لها. قياس المسافة بين طرف الأمامي من غضروف ميكل والفك العلوي (غيض من لوحة الغربالية) في ميكرون. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حساب متوسط ​​النزوح من يرقات الأسماك متعددة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخراج البيانات النزوح من الطراز. استخدام متوسط ​​النزوح المحسوبة في 6.8 للتحقق من السلوك النزوح نموذجي ( <stronز&gt; الشكل 4). إذا ينحرف نموذج من المتوقع، تحليل الحساسية تشغيل عن طريق تغيير خصائص المواد بالتتابع والأحمال العضلات. </li></ol>

<ol><li>Rayfield, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Finite+Element+Analysis+and+Understanding+the+Biomechanics+and+Evolution+of+Living+and+Fossil+Organisms%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Earth+Planet.+Sci%22%5BJournal%5D)">Finite Element Analysis and Understanding the Biomechanics and Evolution of Living and Fossil Organisms.</a> Annu. Rev. Earth Planet. Sci. 35, 541-576 (2007).</li>
<li>Rao, S. S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRao%2C+SS+%22The+Finite+Element+Method+in+Engineering%3A+Fifth+Edition%22">The Finite Element Method in Engineering: Fifth Edition</a>. , (2010).</li>
<li>Taylor, M., Prendergast, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Four+decades+of+finite+element+analysis+of+orthopaedic+devices%3A+Where+are+we+now+and+what+are+the+opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomech%22%5BJournal%5D)">Four decades of finite element analysis of orthopaedic devices: Where are we now and what are the opportunities.</a> J Biomech. 48, 767-778 (2015).</li>
<li>Button, D. J., Rayfield, E. J., Barrett, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cranial+biomechanics+underpins+high+sauropod+diversity+in+resource-poor+environments%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Royal+Soc+London+B%3A+Biol+Sci.+281%22%5BJournal%5D)">Cranial biomechanics underpins high sauropod diversity in resource-poor environments.</a> Proc Royal Soc London B: Biol Sci. 281. 281, (2014).</li>
<li>Mammoto, T., Mammoto, A., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanobiology+and+developmental+control%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Mechanobiology and developmental control.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 29, 27-61 (2013).</li>
<li>Shwartz, Y., Farkas, Z., Stern, T., Aszodi, A., Zelzer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle+contraction+controls+skeletal+morphogenesis+through+regulation+of+chondrocyte+convergent+extension%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+biol%22%5BJournal%5D)">Muscle contraction controls skeletal morphogenesis through regulation of chondrocyte convergent extension.</a> Dev biol. 370, 154-163 (2012).</li>
<li>Rolfe, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+mechanosensitive+genes+during+skeletal+development%3A+alteration+of+genes+associated+with+cytoskeletal+rearrangement+and+cell+signalling+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+genomics%22%5BJournal%5D)">Identification of mechanosensitive genes during skeletal development: alteration of genes associated with cytoskeletal rearrangement and cell signalling pathways.</a> BMC genomics. 15, 48(2014).</li>
<li>Roddy, K. A., Kelly, G. M., van Es, M. H., Murphy, P., Prendergast, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+patterns+of+mechanical+stimulation+co-localise+with+growth+and+cell+proliferation+during+morphogenesis+in+the+avian+embryonic+knee+joint%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomech%22%5BJournal%5D)">Dynamic patterns of mechanical stimulation co-localise with growth and cell proliferation during morphogenesis in the avian embryonic knee joint.</a> J Biomech. 44, 143-149 (2011).</li>
<li>Haudenschild, D. R., Chen, J., Steklov, N., Lotz, M. K., D'Lima, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+chondrocyte+actin+cytoskeleton+in+living+three-dimensional+culture%3A+response+to+anabolic+and+catabolic+stimuli%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+cell+biomech%22%5BJournal%5D)">Characterization of the chondrocyte actin cytoskeleton in living three-dimensional culture: response to anabolic and catabolic stimuli.</a> Mol cell biomech. 6, 135-144 (2009).</li>
<li>Nowlan, N. C., Murphy, P., Prendergast, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dynamic+pattern+of+mechanical+stimulation+promotes+ossification+in+avian+embryonic+long+bones%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomech%22%5BJournal%5D)">A dynamic pattern of mechanical stimulation promotes ossification in avian embryonic long bones.</a> J Biomech. 41, 249-258 (2008).</li>
<li>Giorgi, M., Carriero, A., Shefelbine, S. J., Nowlan, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanobiological+simulations+of+prenatal+joint+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomech%22%5BJournal%5D)">Mechanobiological simulations of prenatal joint morphogenesis.</a> J Biomech. 47, 989-995 (2014).</li>
<li>Heegaard, J. H., Beaupre, G. S., Carter, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanically+modulated+cartilage+growth+may+regulate+joint+surface+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Ortho+Res%22%5BJournal%5D)">Mechanically modulated cartilage growth may regulate joint surface morphogenesis.</a> J Ortho Res. 17, 509-517 (1999).</li>
<li>Hammond, C. L., Schulte-Merker, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+populations+of+endochondral+osteoblasts+with+differential+sensitivity+to+Hedgehog+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Two populations of endochondral osteoblasts with differential sensitivity to Hedgehog signalling.</a> Development. 136, 3991-4000 (2009).</li>
<li>Mitchell, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+tools+for+studying+osteoarthritis+genetics+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoarthritis+and+cartilage+%2F+OARS%2C+Osteoarth+Res+Soc%22%5BJournal%5D)">New tools for studying osteoarthritis genetics in zebrafish.</a> Osteoarthritis and cartilage / OARS, Osteoarth Res Soc. 21, 269-278 (2013).</li>
<li>Elworthy, S., Hargrave, M., Knight, R., Mebus, K., Ingham, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+multiple+slow+myosin+heavy+chain+genes+reveals+a+diversity+of+zebrafish+slow+twitch+muscle+fibres+with+differing+requirements+for+Hedgehog+and+Prdm1+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Expression of multiple slow myosin heavy chain genes reveals a diversity of zebrafish slow twitch muscle fibres with differing requirements for Hedgehog and Prdm1 activity.</a> Development. 135, 2115-2126 (2008).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Danieau%27s+solution+%2830%C3%97%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Prot%22%5BJournal%5D)">Danieau's solution (30×).</a> Cold Spring Harb Prot. , pdb.rec12467 (2011).</li>
<li>Iorga, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micromechanical+function+of+myofibrils+isolated+from+skeletal+and+cardiac+muscles+of+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+physiol%22%5BJournal%5D)">Micromechanical function of myofibrils isolated from skeletal and cardiac muscles of the zebrafish.</a> J Gen physiol. 137, 255-270 (2011).</li>
<li>Tanck, E., Blankevoort, L., Haaijman, A., Burger, E. H., Huiskes, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+muscular+activity+on+local+mineralization+patterns+in+metatarsals+of+the+embryonic+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Ortho+Res%22%5BJournal%5D)">Influence of muscular activity on local mineralization patterns in metatarsals of the embryonic mouse.</a> J Ortho Res. 18, 613-619 (2000).</li>
<li>Tanck, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanical+consequences+of+mineralization+in+embryonic+bone%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">The mechanical consequences of mineralization in embryonic bone.</a> Bone. 35, 186-190 (2004).</li>
<li>Brunt, L. H., Norton, J. L., Bright, J. A., Rayfield, E. J., Hammond, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Finite+element+modelling+predicts+changes+in+joint+shape+and+cell+behaviour+due+to+loss+of+muscle+strain+in+jaw+development%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomech%22%5BJournal%5D)">Finite element modelling predicts changes in joint shape and cell behaviour due to loss of muscle strain in jaw development.</a> J Biomech. 48, 3112-3122 (2015).</li>
<li>Roddy, K. A., Prendergast, P. J., Murphy, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+influences+on+morphogenesis+of+the+knee+joint+revealed+through+morphological%2C+molecular+and+computational+analysis+of+immobilised+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Mechanical influences on morphogenesis of the knee joint revealed through morphological, molecular and computational analysis of immobilised embryos.</a> PloS one. 6, e17526(2011).</li>
<li>Cuff, A. R., Bright, J. A., Rayfield, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+experiments+on+finite+element+models+of+an+ostrich+%28Struthio+camelus%29+cranium%5BTitle%5D)+AND+%22Peer+J%22%5BJournal%5D)">Validation experiments on finite element models of an ostrich (Struthio camelus) cranium.</a> Peer J. 3, 1294(2015).</li>
<li>Schilling, T. F., Kimmel, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Musculoskeletal+patterning+in+the+pharyngeal+segments+of+the+zebrafish+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Musculoskeletal patterning in the pharyngeal segments of the zebrafish embryo.</a> Development. 124, 2945-2960 (1997).</li>
<li>Dowthwaite, G. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mechanism+underlying+the+movement+requirement+for+synovial+joint+cavitation%5BTitle%5D)+AND+%22Matrix+biol%22%5BJournal%5D)">A mechanism underlying the movement requirement for synovial joint cavitation.</a> Matrix biol. 22, 311-322 (2003).</li>
<li>Nia, H. T., Han, L., Li, Y., Ortiz, C., Grodzinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poroelasticity+of+cartilage+at+the+nanoscale%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Poroelasticity of cartilage at the nanoscale.</a> Biophys J. 101, 2304-2313 (2011).</li>
</ol>

الكتاب ليس لديهم ما يكشف. وقد طبع بعض البيانات في التين 3-5 من J.Biomech، 48 (12)، برانت وآخرون، والنمذجة عنصر محدود يتوقع تغييرات في شكل مشترك وسلوك الخلية بسبب فقدان شد عضلي في التنمية الفك، 3112-22. 2015، بإذن من السيفير 15.

وقد استخدمت نماذج عنصر محدود لربط المناطق من العناصر الهيكلية التي هي تحت ضغط مع تلك التي تتعرض لتكوين العظام 10، وكذلك لرسم خريطة للمناطق تحت الضغط خلال التحجر غضروفي والتشكل مشترك 8،12،21. وكانت دراسات أخرى أيضا قادرة على تطبيق نماذج النمو النظرية لتكرار التغييرات خلال التنمية المشتركة 11،12. هنا نعرض بروتوكول لبناء نماذج FE للنظام بسيط نسبيا، الفك الزرد 20. خلافا لأساليب بديلة لجمع الصور الخام للنماذج FE، مثل الفحص بالاشعة المقطعية 22، التصوير متحد البؤر من خطوط المعدلة وراثيا أو الزرد immunostained يسمح لأنسجة متعددة لدراستها. فإنه يمكن، بالتالي، تقديم معلومات مباشرة على نقاط التعلق العضلات فيما يتعلق الغضروف. ومن بين النماذج الفقاريات الزرد قابلة جدا للتلاعب الجيني والدوائي. توليد نماذج FE لالزردالغضروف القحفي يفتح حتى الآن إمكانية إجراء مزيد من الدراسة للتفاعل بين الميكانيكا الحيوية وعلم الوراثة في التشكل المشترك. وهناك عدد من الخطوات الحاسمة لعملية خلق نموذج FE. الأول هو توليد تمثيل دقيق ثلاثي الأبعاد للنظام. وهذا يتطلب التصوير في قرار مرتفع بما فيه الكفاية أن تحدد بوضوح حدود. لاحظ أنه حتى مع ارتفاع القرار التصوير لجعل سطح جيد واحد قد يكون لتذليل بعض المناطق. خطوة حاسمة أخرى هي تحديد موضع الصحيح للتحميل والقيود الصحيحة. ستفشل نموذج مقيدة بما فيه الكفاية لحلها وسوف وضع غير صحيح من الأحمال يسبب حركة غير طبيعية. بعض معالجة البيانات الخام (الشكل 2) ضروري كسطح المتولدة من البيانات الخام سيكون من الصعب شبكة (الشكل 2B). نحن تصفية البيانات باستخدام فلتر جاوس (الشكل 2C </sترونج&gt;) وأجرينا بعض الصقل اليدوي للمنحنيات لإنتاج مجموعة من الخطوط العريضة النظيفة التي يمكن تحويلها إلى سطح 3D. والكثير من تجانس يمكن أن يؤدي إلى &quot;ذاب&quot; السطحية التي فقدت الكثير من معالمه. اختيار حجم العنصر الصحيح هو عملية تكرارية مثل اختيار صغيرة جدا حجم عنصر يخلق كبيرة جدا شبكة الذي هو كثافة حسابيا. ومع ذلك، اختيار كبير جدا حجم العنصر سوف تنتج شبكة الذي فشل في تلخيص الشكل الصحيح للهيكل. وكانت شبكة الصحيحة أصغر حجم العناصر التي استولت على الشكل الصحيح من الفك وتلاقت على الحل الصحيح، التحقق منها باستخدام النزوح الفك. قد يكون من الضروري أيضا تعديل خصائص المواد أو حسابات الحمل لمحاكاة أفضل تشريد الصحيح كما الأعمار والأنواع المختلفة سيكون لها خصائص مختلفة إلى حد كبير. من المهم أن نتذكر أن هناك دائما حدود لنموذج افتراضي و<html> جعل ssumptions لتشغيل نماذج FE. عندما وضع نماذج فقط واحد أو عدد قليل من عينات من الأهمية بمكان لضمان أن عينة تمثيلية يتم اختيار كما أن هناك احتمالا أن تكون الاختلافات الصغيرة بين الأفراد. كما أدرجت فقط بعض العناصر الفك والعضلات، وهذا النموذج هو نسخة مبسطة من نظام العضلات والعظام القحفي الزرد. ولذلك، كان القيود على وضعه لحساب حيث العناصر الفك غرار سوف يربط مع بقية الجمجمة ونموذج مقيدة بشكل مصطنع في وسط لاصلاحها في &quot;الفضاء&quot;. لم هذا القيد الاصطناعي لن يؤثر على تفسير استخلاصها من نماذج مثل قرني لامي لم تحلل نفسها. إدراج أكثر من هيكل القحفي، خصوصا الأخرى الفك فتح العضلات مثل sternohyals والغضاريف المرفقة به 23، يمكن أن تضاف إلى هذا النموذج، وإنما تشمل القيود على قدرة النماذج الكبيرة للتشغيل في البرنامج عنصر محدود. <html> الصورة = &quot;jove_content&quot;&gt; الحد الآخر هو أننا لم غرار الرباط الإدراج، رغم أن هذا يمكن تحقيقه عن طريق إدخال الينابيع 8. كان واحدا افتراض الأخرى التي تقدمت بها في هذه الحالة أن هذا النموذج سوف تتصرف خطيا. وكانت مقادير من الضغوط على نماذج مماثلة لتلك التي في النماذج المنشورة وتطبيقها على خلايا في المختبر 10،24، مع سلالات يجري تحت 3500 وفوق -5000 μɛ بصرف النظر عن القيد والتعلق العضلات نقطة. لذلك، اعتبرت السلالات في المناطق ذات الصلة من طراز ضمن نطاق مقبول لنموذج خطي. الغضروف لا تتصرف تماما كمادة الخطية وسبق غرار كمادة poroelastic، مما مكن تحليل سلوك السوائل في نموذج 25. ان نشر نقاط التعلق العضلات بين مجموعة من العقد المحلية توزيع القوات الذروة وتمثل أكثر دقة الإدراج العضلات لعضلات معينة. والأنف والحنجرة &quot;&gt; استخدام FE يتيح إجراء تقييم للسلالات والضغوط بناء على الهيكل. وتقنية في كثير من الأحيان يتم استخدامه في العديد من التخصصات العلوم الحيوية بما في ذلك العظام، علم المتحجرات ومؤخرا البيولوجيا التطورية. نحن هنا تصف كيفية بناء فاس للالزرد الفك السفلي، وفي المستقبل يمكن تمديد هذه النماذج للنظر في الفك كله، بما في ذلك الحنك. تقنيات مماثلة يمكن استخدامها لنموذج الميكانيكا الحيوية في العمود الفقري في الأسماك، والتي حتى الآن لم معظمها تم دراستها من قبل وسائل الحركية.

محدود عنصر (FE) النمذجة هي تقنية الهندسة التي يمكن حساب حسابيا ورسم خريطة لحجم وموقع السلالات بناء على هيكل 1. يتكون نموذج للهيكل 3D، ممثلة شبكة من &quot;العناصر المحددة&quot;، ويخضع النتيجة النهائية للتحليل من قبل عدد من العوامل بما في ذلك هيكل وعدد من العناصر في شبكة، وحجم وموقع الميكانيكية الأحمال وخصائص المواد. خصائص المواد تصف جوانب معينة من السلوك مادة تحت نوع معين من الحمل. معامل يونج (E) يصف مرونة من المواد في حين يصف نسبة بواسون الانخفاض النسبي في عرض مادة طوله عند امتدت عينة. FE نماذج يمكن استخدامها لحساب مجموعة متنوعة من العوامل بما فيها التهجير، والإجهاد والضغط والإجهاد يتصرف على هذا النموذج من قبل مع الأخذ بعين الاعتبار إدخال البيانات فريدة من نوعها حول الهيكل &#39;؛ ق الشكل والموقع وحجم الأحمال وخصائص المواد المحددة. ويستخدم على نطاق واسع FE النمذجة في الهندسة (2) وعلى نحو متزايد لتقويم العظام 3 و الحفرية التطبيقات 4. وفي تطور معروفة قوات النشاط الحيوي ليكون بمثابة حافز في العديد من الخلايا لتنشيط استجابة خلايا 5-8 ومن المفيد للتنبؤ على حد سواء المواقف النسبية والمقادير من المحفزات الميكانيكية في تطوير أجهزة الجسم، ومع ذلك، في الوقت الحالي وقد FE النمذجة تستخدم إلا قليلا للتنمية الزرد. وقد تبين أن كلا الغضاريف والعظام أن تكون المواد mechanosensitive. على سبيل المثال، تم العثور في المختبر ضغط لتفعيل مسارات المولدة للغضروف، في حين ثبت التوتر أنها ضرورية لتكوين العظام 9. وقد استغلت FE التحليل (الهيئة الاتحادية للبيئة) لنموذج السلالات بناء على العينات البيولوجية، بما في ذلك أولئك الذين يعملون على عناصر الهيكل العظمي خلال العظام FOrmation 10. وتشمل التطبيقات الإنمائية الأخرى استخدامه للتنبؤ شكل مشترك بعد تعرضها لقوات النشاط الحيوي النظرية 11،12 ولإظهار نمط من السلالات الحالية خلال كتكوت الركبة التشكل مشترك 8. ويهدف هذا البروتوكول إلى تبادل الخبرات لتوليد السطوح 3-الأبعاد، تنسجم ونماذج عنصر محدود من الصور مبائر بهدف فهم اليات الأنسجة النامية. وتبين لنا أيضا طرق المصادقة على النماذج FE الرغم من التقاط المعلومات والتشريد مشتركة الحقيقية في الجسم الحي. بينما نستخدم الفك الزرد باعتباره نموذجا نفس تقنيات يمكن استخدامها على أي نظام البيولوجي الصغيرة التي يمكن الحصول على معلومات 3D على هيكل الجهاز العضلي الهيكلي بواسطة التصوير متحد البؤر أو multiphoton.

<table><tbody><tr><td>Coll2</td><td>Abcam</td><td>ab34712</td><td>الجسم المضاد للكولاجين من النوع الثاني - بقع جميع الغضاريف</td></tr><tr><td>A4.1025 / MF20</td><td>دراسات التنموية بنك الورم الهجين</td><td>A4.1025</td><td>الجسم المضاد للميزوين الهيكلي - علامات على جميع عضلات الهيكل العظمي &nbsp;</td></tr><tr><td>انخفاض الذوبان agarose</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>A9414-5G</td><td>لتركيب أسماك الزرد</td></tr><tr><td>MS222 (إيثيل 3-أمينوبنزوات ميثان سولفونات)</td> <td>سيجما</td><td>E10521-10G</td><td>لصنع مخدر</td></tr><tr><td>التربسين</td><td>فيشر</td><td>T / 3760/48</td><td>عينة نفاذية</td></tr><tr><td>Dylight 488 Mouse IgG</td><td>Thermofisher</td><td>35502</td><td>الجسم المضاد الثانوي</td></tr><tr><td>Dylight 550 Rabbit IgG</td><td>Thermofisher &nbsp ؛</td><td>84541</td><td>الجسم المضاد الثانوي</td></tr><tr><td>SP8 / SP5 أو SPE متحد البؤر</td><td>Leica &nbsp ؛</td><td></td><td>للتصوير &nbsp;</td></tr><tr><td>برنامج التقاط LAS Leica</td><td>برنامج Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Imaging Aviso (الإصدار 7.0.0)</td>برنامج تحليل الصور <td>ثلاثي الأبعاد لمجموعة</td><td></td> FEI <td>Visualization Science Group (القسم 2)</td></tr> <tr><td>جزء Hypermesh من حزمة Hyperworks (الإصدار 10) برنامج</td> <td>إنشاء نموذج Altair Engineering</td><td></td><td>FE (القسم 4-5)</td></tr> <tr><td>Abaqus (الإصدار 6.14)</td> برنامج <td>تحليل SIMULIA</td><td></td><td>FE (القسم 5.7-5.8)</td></tr></tbody></table>

بناء نماذج العناصر المحدودة المعنية بالتحقيق في الزرد الفك الميكانيكا الحيوية

Building Finite Element Models to Investigate Zebrafish Jaw Biomechanics

يحدث التشكل الهيكلي من خلال سلوكيات الخلايا المنظمة بإحكام أثناء التطور ؛ العديد من أنواع الخلايا تغير سلوكها استجابة للإجهاد الميكانيكي. تخضع المفاصل الهيكلية للتحميل الميكانيكي الديناميكي. تحليل العناصر المحدودة (FEA) هو طريقة حسابية ، تستخدم بشكل متكرر في الهندسة والتي يمكنها التنبؤ بكيفية استجابة المادة أو الهيكل للمدخلات الميكانيكية. من خلال تقسيم نظام كامل (في هذه الحالة الهيكل العظمي لفك الزرد) إلى شبكة من "العناصر المحدودة" الأصغر ، يمكن استخدام FEA لحساب الاستجابة الميكانيكية للهيكل للأحمال الخارجية. يمكن تصور النتائج بعدة طرق بما في ذلك "خريطة حرارية" توضح موضع الحد الأقصى والحد الأدنى للسلالات الرئيسية (تشير السلالة الرئيسية الإيجابية إلى التوتر بينما تشير السلبية إلى الضغط. يشير الحد الأقصى والحد الأدنى إلى أكبر وأصغر سلالة). يمكن استخدامها لتحديد مناطق الفك وبالتالي الخلايا التي من المحتمل أن تكون تحت أحمال شد أو ضغط عالية بشكل خاص أثناء حركة الفك ، وبالتالي يمكن استخدامها لتحديد العلاقات بين الإجهاد الميكانيكي وسلوك الخلية. يصف هذا البروتوكول خطوات إنشاء نماذج العناصر المحدودة من بيانات الصورة متحدة البؤر على الجهاز العضلي الهيكلي ، باستخدام الفك السفلي لسمك الزرد كمثال عملي. يقود البروتوكول القارئ من خلال سلسلة من الخطوات: 1) تلطيخ المكونات العضلية الهيكلية ، 2) تصوير المكونات العضلية الهيكلية ، 3) بناء سطح ثلاثي الأبعاد (3D) ، 4) توليد شبكة من العناصر المحدودة ، 5) حل FEA وأخيرا 6) التحقق من صحة النتائج بالمقارنة مع الإزاحة الحقيقية التي شوهدت في حركات فك السمكة.

المناعية للعضلة (الشكل 1A) والغضاريف (الشكل 1B) أو التصوير من الصحفيين المعدلة وراثيا (الشكل 1C) يسمح للهيكل 3D من الفك أن تصور، جنبا إلى جنب مع الجهاز العضلي المرتبطة بها. بواسطة التصوير بدقة عالية كان من الممكن لبناء نموذج الذي يلتقط كل من شكل ثلاثي الأبعاد من الفك (الشكل 2) والموقع ووضع الأحمال (الشكل 3). استخدام في نزوح فيفو ينظر من خلال التقاط فيديو عالي السرعة (الشكل 4) ونحن التحقق من أن مجموعة من الحركة في النموذج كان ضمن مجموعة واقعية. يمكن استخدام نماذج FE مرة واحدة المدى لعرض مجموعة من البيانات، مثل الإجهاد (الشكل 5A)، والحد الأدنى والحد الأقصى للسلالة الرئيسي (الشكل 5B - K). هذه النتائج هي ثلاثة قاتمة،<html> ensional ذلك نموذج يمكن تضخيم لمعرفة أنماط غرامة من التفاصيل (الشكل 5E، 5I) استدارة للحصول على وجهات النظر ذات الصلة (الشكل 5F، 5G، 5J، 5K) ومقطوع رقميا (الشكل 5E، 5E &#39;&#39;، 5I، 5I &#39;&#39;) لإظهار كيف أن أنماط من الإجهاد أو سلالة أو التغير في الضغط طوال هذا النموذج. ومن الممكن أيضا لاستخراج البيانات الكمية من طراز (لا يظهر). من خلال التحقق من نموذج وباستخدام أدق خصائص المواد، والأحمال وشبكة شكل نموذج FE يمكن استخدامها لاستكشاف أفضل تقدير للبيئة الميكانيكية التي تمر بها الخلايا خلال تلك النافذة التنمية. نتائج نموذج يمكن مقارنة مباشرة للتغيرات في السلوك الخلوية والتعبير الجيني 20. <html> إعادة 1 &quot;SRC =&quot; / ملفات / ftp_upload / 54811 / 54811fig1.jpg &quot;/&gt; الشكل 1: صور الممثل من العناصر العضلات والعظام من الفك السفلي الزرد في 5 DPF مداخن متحد البؤر التمثيلية للالفك السفلي من اليرقات 5dpf كلها تظهر مع الأمامي إلى أعلى (A) المناعية للA4.1025 التي بقع جميع الميوسين الهيكل العظمي (ب) المناعية لنوع الثاني الكولاجين الذي يصادف كل الغضروف (C) كومة من يرقة حية معربا عن صحفيين col2a1 المعدلة وراثيا: mCherry علامات الغضروف (الحمراء)، وsmyhc: GFP العضلات بطيئة (الأخضر). IA: intermandibularis الأمامي، PH: منقلة اللامي، AM: المقربة الفك السفلي، مرحبا: اللامي السفلي، مرحبا: اللامي متفوقة، CH: القصية اللامية، MC: غضروف ميكل، PQ: Palatoquadrate، CH: قرني لامي <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54811/54811fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> &quot;FO: المحافظة على together.within الصفحات =&quot; 1 &quot;&gt; <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/54811/54811fig2.jpg" /> الشكل 2: جيل من سطح 3D من البيانات مبائر الصور تظهر الانتقال من البيانات مبائر إلى 3D سطح الفك السفلي الزرد مع التكبير العالي في المنطقة المشتركة. (أ) البيانات متحد البؤر الخام. (ب) الإدراجات بعد تطبيق فلتر التمويه. (ج) مخطط تصفيتها. سطح (D) 3D. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54811/54811fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل (3)" src="/files/ftp_upload/54811/54811fig3.jpg" /> الشكل (3): شبكة الممثل تظهر القيود وناقلات قوة تنسجم التمثيلية لليرقة 5 DPF ل(A) إغلاق الفم و.(ب) فتح الفم. بقع بيضاء دلالة على الأماكن التي يتم تقييد نموذج والتي الأبعاد (على سبيل المثال، x و y أو X و Y و Z). خطوط بيضاء تدل على مواقع العضلات، مع ناقل القوة العضلية الرمز بواسطة السهام البيضاء. يظهر الأحمر الغضروف والاصفر interzone. تم تعديل هذا الرقم من المواد التكميلية التي نشرت سابقا في برانت وآخرون. 15. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54811/54811fig3large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل (4)" src="/files/ftp_upload/54811/54811fig4.jpg" /> الرقم 4: اختبار الحساسية FE-نموذج محاكاة النزوح الفك في الزرد 5dpf لغضروف مختلفة والرجوعية يونغ interzone. الفك النزوح (مفتوح ليغلق في ميكرون) وضعت على الفك. سجلت باستخدام مفتاح اللون. كل نموذج (أ - L) لديها مجموعة مختلفة من الغضروف (ج = 1.1، 3.1، أو 6.1 ميجا باسكال) أو interzone (ط = 0.25، 0.5، 0.75، أو 1 ميجا باسكال) الخصائص. الأفقي السهم الأسود يسلط الضوء على قيمة النزوح الفك في غيض من غضروف ميكل (ويمثلها السهم الأسود العمودي). M و N لقطات من الفيديو من 5 يرقات DPF تبين الحد الأدنى، أي مغلق الفك (M) والحد الأقصى، أي الفك مفتوحة بالكامل (N) مع اثنين من فرضه (O) - خط أبيض حول O يمثل تشريد (43 ميكرون). في هذه الحالة النسبية خصائص غضروف 1.1 مع interzone 0.25 (أ) أفضل مباراة نزوح ينظر في الأسماك الحية (O). لوحات AL هذا الرقم يكون قد سبق نشرها في برانت وآخرون. 15. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54811/54811fig4large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض أكبر فرس</a>أيون من هذا الرقم. <img alt="الرقم 5" src="/files/ftp_upload/54811/54811fig5.jpg" /> الرقم 5: بيانات تمثيلية من نماذج المحاكاة FE FE-نموذج من جميع عضلات تطبيقها في 5 DPF يرقة (A - C). (A) فون ميزس (EMaxmin) (ب) سلالة الحد الأدنى الرئيسي (E مين. P، μɛ) (C) سلالة الرئيسي أقصى (E ماكس. P.، μɛ). محاكاة FE-نموذج من السلالات الرئيسية القصوى والدنيا خلال فتح الفك. (D - K): سلالة الرئيسي أقصى (. إي ماكس P.، μɛ) في (د) عرض الفك بطني و (E) عرض مشترك بطني (E) يبين موقع أقسام الداني القاصي من خلال غضروف ميكل المشتركة وinterzone في (E &#39;) و (E&#39; &#39;)، على التوالي. (F): الجانبيالفك الرأي. (G): عرض مشترك الجانبي. (H - K): سلالة الرئيسي الحد الأدنى (هاء مين P، μɛ) في (H) عرض الفك بطني و(I) عرض مشترك بطني. (I) ويبين موقع المقاطع الداني القاصي من خلال مشترك غضروف ميكل وinterzone في (أنا &#39;) و (أنا&#39; &#39;) على التوالي (J): الجانبي عرض الفك. (K): عرض مشترك الجانبي. وقد تم هذا الرقم المنشور سابقا في برانت وآخرون. 15. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54811/54811fig5large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td></td><td> عدد من الألياف العضلية </td><td> منطقة الألياف العضلية (ميكرون 2) </td><td> منطقة مجموعة العضلات (ميكرون2) </td><td> قوة (N) </td></tr><tr><td> 5 DPF intermandibularis الأمامي </td><td> 5 </td><td> 23.8 </td><td> 119 </td><td> 4.76e-6 </td></tr><tr><td> 5 DPF منقلة اللامي </td><td> 6 </td><td> 23.8 </td><td> 142.8 </td><td> 5.71e-6 </td></tr><tr><td> 5 DPF المقرب الفكية </td><td> 9 </td><td> 23.8 </td><td> 214.2 </td><td> 8.57e-6 </td></tr></tbody></table> الجدول 1: الكمي العضلات. محسوب متوسط قوات العضلات لIntermandibularis الأمامي، المقرب للفك والمنقلة اللامي في 5 DPF باستخدام 40 ن ن / ميكرون 2 (القيمة في وحدة المساحة المأخوذة من الإشارة 17). (Lorga وآخرون، 2011) (ن = 3).

تحليل العناصر المحدودة هو أداة شائعة الاستخدام للتحقيق في الأداء الميكانيكي للهياكل تحت الحمل. هنا نطبق استخدامه على نمذجة الميكانيكا الحيوية لفك الزرد.

Skeletal morphogenesis occurs through tightly regulated cell behaviors during development; many cell types alter their behavior in response to mechanical ...

الهدف العام من تقنية النمذجة هذه هو محاكاة البيئة الميكانيكية التي تتعرض لها فكوك أسماك الزيبرا أثناء نموها. ويمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجال الجهاز العضلي الهيكلي، مثل: كيف تتغير أنماط الحمل الميكانيكي بمرور الوقت؟ وكيف تحفز هذه الأحمال سلوك الخلايا.تكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية في أنها تتيح لنا تحليل أنماط التعبير الجيني والتغيرات في سلوك الخلايا في سياق البيئة الميكانيكية. ويمكن لهذه الطريقة أن توفر رؤى حول التطور الهيكلي، كما يمكن تطبيقها على أي بنية بيولوجية أخرى تتعرض لحمل ميكانيكي، مثل العناصر الهيكلية في الفقاريات العليا أو الجهاز القلب الوعائي.بشكل عام، قد يواجه الأفراد المبتدئون في هذه الطريقة بعض الصعوبات، لأن المصطلحات والبرامج المستخدمة تفترض وجود خلفية في الهندسة. ولتصوير شكل العناصر الهيكلية، وقياس كمية العضلات، وتحديد الموضع الدقيق لارتباطات العضلات، قم بإجراء صبغ مناعي للأسماك في العمر المناسب للكشف عن الميوزين الهيكلي والكولاجين من النوع II. أولاً، قم بتثبيت يرقة السمكة في 4%paraformaldehyde وPBS لمدة ساعة واحدة.بعد ذلك، يتم غسل المادة المثبتة باستخدام غسلتين من محلول PBT. ثم يتم تجفيف اليرقة في مزيج من الميثانول بتركيز 50% ومحلول PBT لمدة خمس دقائق، يليه الميثانول بتركيز 100% لمدة خمس دقائق. يمكن بعد ذلك تخزين اليرقات في ميثانول بتركيز 100% حتى وقت الحاجة إليها.عند الحاجة، يتم إعادة ترطيب اليرقة في 50% methanol وPBT لمدة خمس دقائق. بعد ذلك، تُغسل في PBT لمدة خمس دقائق. الآن، يتم نفاذ اليرقة باستخدام 0.25% trypsin وPBT على الثلج لمدة تتراوح بين خمس إلى ست دقائق.بعد ذلك، اغسلها في PBT لمدة خمس دقائق وكرر غسيل PBT ثلاث مرات أخرى. وقبل تطبيق الأجسام المضادة، قم بحجب اليرقة لمدة تتراوح من ساعتين إلى ثلاث ساعات في 5% serum وPBT. ثم، قم بتحضين اليرقة في التخفيف الموصى به من rabbit anti-type II collagen وmouse anti-myosin antibodies مع 5% serum وPBT.يتم إجراء هذه الحضنة لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة، أو طوال الليل عند درجة حرارة 4 °C. بعد إضافة الأجسام المضادة الأولية، تُغسل اليرقة باستخدام PBT لست مرات إجمالاً، لمدة 15 دقيقة في كل غسلة. بعد عمليات الغسل بـ PBT، يتم تطبيق سدادة (block) مكونة من serum بنسبة 5% وPBT لمدة ساعة أو ساعتين.الآن، قم بإضافة الأجسام المضادة الثانوية، مع الحرص من الآن فصاعداً على إبقاء العينة في الظلام قدر الإمكان. استخدم أجساماً مضادة ثانوية مضادة للفئران ومضادة للأرانب مُوسومة فلورياً في مصل بنسبة 5% وPBT. بعد إضافة الأجسام المضادة الثانوية، اغسل اليرقة في PBT ست مرات، لمدة 10 دقائق لكل غسلة.يمكن الآن تصوير أي يرقات تم صبغها كما هو موضح، أو التي تعبر عن علامات فلورية، باستخدام مجهر كونفوكالي وفقاً لما يلي. يتم التقاط مجموعة صور كونفوكالية متتالية (stack) للمنطقة المستهدفة باستخدام عدسة شيئية بقوة 10x مع تكبير رقمي بنسبة 2.5x تقريباً. يتم تحفيز القناتين الخضراء والحمراء باستخدام ليزر بطول موجي 488-nanometer وليزر بطول موجي 561-nanometer.بعد ذلك، التقط صورًا بدقة 512 بكسل مربع باستخدام فاصل للمستوى z قدره 1.3 microns مع ثلاثة متوسطات للخطوط. ستملأ حوالي 100 مقطع z المجموعة. قم بتصدير البيانات كمجموعة صور TIFF.افتح مجموعة صور TIFF وعاين جميع القنوات باستخدام البرنامج المناسب. انقر بزر الماوس الأيمن على قناة الغضروف، واختر orthoslice، ثم اضغط على create. بعد ذلك، انقر بزر الماوس الأيمن على قناة الغضروف واختر Image Processing، ثم Smoothing And Denoising، وحدد image filter، وفعّل smoothing Gaussian.في عرض المشروع، انقر بزر الماوس الأيمن فوق الصورة المفلترة واختر تقسيم الصورة (image segmentation)، ثم تحرير تسمية جديدة (edit new label). أنشئ تسمية جديدة لكل مادة، مثل الغضروف والمفصل. بعد ذلك، حدد منطقة الغضروف في الصورة باستخدام أداة العصا السحرية مع تفعيل خيار جميع الشرائح (all slices)، واستخدم أداة الفرشاة لإزالة الضوضاء من الخطوط الخارجية.بعد ذلك، حدد منطقة المفصل باستخدام أداة الفرشاة (brush tool)، وقم بتعيينها لمكون المفصل، وكرر هذه العملية في جميع أنحاء المفصل. ولتنعيم عدة شرائح في وقت واحد، اختر "Segmentation" من القائمة العلوية، ثم اختر "Smooth labels". بعد ذلك، لإنشاء تمثيل سطحي ثلاثي الأبعاد للمكون، انقر بزر الفأرة الأيمن على الصورة واختر "Generate Surface".الآن، انقر على السطح المُصيَّر، واحفظ البيانات كملف HMASCII من أجل برنامج إنشاء الشبكات. يعد توليد الشبكة ثلاثية الأبعاد خطوة حاسمة في إنشاء نموذج جيد. يجب عليك إيجاد توازن بين شبكة تمثل الشكل الحقيقي للهيكل الذي تحاول نمذجته، وبين عدم تضمين تفاصيل كثيرة تؤدي إلى إدخال عناصر تسبب مشكلات، مثل العناصر ذات الزوايا الصغيرة جداً أو الكبيرة جداً.لإنشاء الشبكة، قم باستيراد النموذج ثلاثي الأبعاد إلى حزمة برمجيات مناسبة. ولإنشاء شبكة ثنائية الأبعاد لأسطح الغضروف والمفصل، استخدم أداة shrinkwrap الموجودة ضمن قائمة 2D. اختر حجم عنصر يتراوح بين 1.5 و 2.5.يمكن إنشاء مجموعة من الشبكات السطحية ذات أحجام مختلفة لإجراء تحسين للشبكة ثلاثية الأبعاد. ولضمان استمرارية الشبكة بين أسطح المفصل والغضروف، يجب أن تتشارك جميع العناصر الموجودة على الحدود في عقد مشتركة. ولتحقيق ذلك، قم بإزالة السطح الداخلي للمفصل، بحيث يتبقى أنبوب مجوف.استخدم مفتاح الوظيفة F2 للوصول إلى اختصار قائمة حذف العناصر (Delete Elements). حدد العناصر المراد حذفها. اضبط العقد الحدودية لتتطابق مع سطح الغضروف.استخدم مجموعة من مفاتيح الوظائف F2 وF3 وF6 لحذف العقد ونقلها وإنشاء عناصر جديدة، على التوالي. وأخيرًا، قم بتكرار سطح الغضروف عند المفصل باستخدام قائمة تنظيم المكونات في المجمع. استخدم مفتاح الوظائف F2 لحذف جميع العناصر غير المفصلية.بعد ذلك، قم بإجراء فحوصات الجودة من خلال الانتقال إلى لوحة فحص العناصر (Check elements). ابحث عن العناصر المكررة، والتدخلات (insertions)، والاختراقات (penetrations) في الشبكة. وفي حال وجودها، قم بتعديلها باستخدام علامة تبويب الأدوات (Tools).تحقق من الزوايا ثنائية السطح باستخدام علامة تبويب الأدوات المساعدة الموجودة في خيار شجرة النموذج. ولإنشاء شبكة ثلاثية الأبعاد من شبكات الأسطح ثنائية الأبعاد ذات أحجام العناصر المختلفة، استخدم أداة Tetramesh. قارن بين أحجام الشبكات المختلفة، واختر نموذج FE صاحب أصغر حجم شبكة يتقارب بعد إجراء المزيد من عمليات المحاكاة، ولا يؤثر سلباً على تعريف الميزات.بعد ذلك، وباستخدام أداة المسافة (Distance tool)، قم بتحويل الشبكة بحيث يكون نموذج الفك متناسباً مع المقياس. تأكد من اتصال مكونات الغضروف والمفصل في النموذج عن طريق تصدير نموذج مدمج، أو باستخدام الروابط (ties). بعد ذلك، قم بتطبيق الأحمال والقيود وخصائص المواد على نموذج العناصر المحدودة (FE model) لمحاكاة وظيفة الفك.باستخدام مجموعات الصور المقطعية المجهرية متحدّة البؤرة (confocal stacks) المحددة كدليل، قم بتعريف العضلات. أولاً، قم بتعيين العقد التي تقابل نقاط ارتباط العضلات. ثم، أنشئ ناقلات بين العقد لتمثيل منشأ واندغام كل عضلة.بعد تحديد جميع العضلات، قم بإنشاء جامع أحمال للتاريخ (history loadcollector)، ثم طبق حملاً مركزاً (Cload) على كل عضلة. حدد المقدار بالنيوتن، وعين المتجه المرتبط به. بعد ذلك، عين خصائص مادة مرنة متجانسة المناحي (elastic isotropic) مناسبة، وفقاً لما تحدده الدراسات المرجعية.بعد ذلك، قم بإنشاء جامع أحمال حدودي (boundary loadcollector)، وقم بتطبيق بعض القيود الأولية على النموذج. اختر العقد المراد تقييدها، وحدد عامل درجات الحرية بما يتناسب مع نطاق الحركة الطبيعي للعضلة التي تحددها تلك العقد. الآن، قم بإنشاء خطوة تحميل لكل نوع من أنواع الحركة المراد محاكاته.من قائمة التحليل، حدد جميع الأحمال والقيود ذات الصلة لمحاكاة الحركة المحددة. بعد ذلك، اختر "static" من القائمة المنسدلة. وعند الجاهزية، قم بتصدير النموذج بتنسيق ملف مناسب، بما يشمل الشبكة والأحمال والقيود وخصائص المواد.في هذه الحالة، يتم اختيار تنسيق INP. بعد ذلك، قم بتحميل النموذج في برنامج تحليل العناصر المحدودة (FE). ومن ثم، قم بإنشاء وتنفيذ مهمة للنموذج، وتحليل المخرجات لمعرفة الإجهاد، والانفعال، والإزاحة، وما إلى ذلك.اختر من ثلاث إلى ست يرقات من سمك الزيبرا المعدل وراثياً، وقم بتخدير اليرقات تخديراً خفيفاً باستخدام 0.02%MS-222 حتى تتوقف عن الاستجابة للمس، مع استمرار نبض قلوبها. بعد ذلك، قم بتثبيت اليرقات جانبياً على شرائح غطاء في 1% agarose منخفض الانصهار فاتر في محلول Danieau. ثم، قم بإزالة الـ agarose بعناية من حول الرأس والفك باستخدام الملقط.بعد ذلك، وباستخدام ماصة باستور، قم بغسل رأس اليرقة بمحلول Danieau الطازج لإزالة المادة المخدرة. استمر في ذلك حتى تعود حركة الفم إلى طبيعتها. الآن، استخدم برنامجاً لالتقاط الفيديو لتصوير فيديوهات فلورية عالية السرعة لحركات الفم.قم بالتصوير بأعلى معدل إطارات للمدة المطلوبة لتسجيل دورات فتح الفك المتعددة. لاحقاً، قم بتحليل أقصى إزاحة للفك. اختر الإطارات التي تظهر الفك مفتوحاً على أوسع مدى، وقم بقياس المسافة بين الطرف الأمامي لغضروف ميكل (Meckel's cartilage) والفك العلوي.تتوافق نقطة الفك العلوي مع طرف الصفيحة الغربالية. ويسمح الصبغ المناعي للعضلات والغضاريف، أو تصوير المراسلين المعدلين وراثياً، بتصور البنية ثلاثية الأبعاد للفك، جنباً إلى جنب مع العضلات المرتبطة به. ومن خلال التصوير بدقة عالية، أمكن بناء نموذج يجسد الشكل ثلاثي الأبعاد للفك.يتضمن النموذج أحمالاً تم اشتقاق مواضعها ومقاديرها من الصور البؤرية للعضلات والغضاريف. وبناءً على هذا النموذج، تم اختبار مجموعة من الخصائص المادية المختلفة. وباستخدام الإزاحة في الجسم الحي التي شوهدت من خلال التصوير بالفيديو عالي السرعة، تم اختيار نموذج واحد هو الذي يحاكي نطاق الحركة هذا بشكل أفضل.باستخدام أدق خصائص المواد والأحمال وبيانات شكل الشبكة، تم استخدام نموذج العناصر المحدودة (FE model) لاستكشاف أفضل تقدير للبيئة الميكانيكية التي يتم التعرض لها خلال هذا الإطار الزمني. على سبيل المثال، تم قياس مقادير الإجهاد. يمكن تكبير النموذج لرؤية التفاصيل الدقيقة للنمط، ثم فحصه في مقاطع رقمية لملاحظة التفاصيل في جميع الأبعاد.بعد مشاهدة هذا الفيديو، سيكون لديك فهم جيد لكيفية استخدام التصوير البؤري (confocal imaging) لبناء نموذج ثلاثي الأبعاد دقيق فسيولوجياً لبنية بيولوجية تخضع لحمل ميكانيكي. وأثناء محاولة تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر أن هذا نموذج خطي مرن، والغضروف لا يتصرف كمادة خطية تماماً. يمكن دمج خصائص مادية أخرى، مثل النفاذية، ولكن قد يتطلب ذلك إجراء تعديلات إضافية على الشبكة (mesh).

building-finite-element-models-to-investigate-zebrafish-jaw

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

علم الأحياء النمائي

في الفك العلوي الزرد بربل هو هيئة المعنى غلافي تحتوي الأدمة ، أرومية متوسطة ومشتقاتها قمة العصبية. الأهم من ذلك ، يمكن تجديد بربل الكبار بعد بتر القريبة. يقدم هذا الفيديو الفك العلوي بربل التنمية ويوضح البروتوكول الجراحية للحث على التجدد ، تليها التصوير جمع ودمج والمصب من العينات باربيل.

طرق لدراسة بربل الفكين اسماك الزرد

الوقت الفاصل بين التصوير متحد البؤر هي تقنية قوية مفيدة لوصف التطور الجنيني. هنا، نحن تصف منهجية وتميز التشكل القحفي في البرية من نوع، وكذلك pdgfra، smad5، وSMO الأجنة متحولة.

تحليل الجمجمة التشكل في الزرد عن طريق 4D متحد البؤر المجهري

الجنين الزرد هو نموذج ممتاز للبحوث البيولوجيا التطورية. خلال مرحلة التطور الجنيني، الزرد تطوير مع كتلة البيض، الذي يعرض التحديات ثلاثي الأبعاد للمراقبة العينة والتحليل. يصف هذا البروتوكول كيفية إنشاء ثنائي الأبعاد جبل الاستعدادات شقة من جبل بأكمله في الموقع (WISH) ملطخة العينات الجنين الزرد.

إعداد جبل مسطح لمراقبة وتحليل الأجنة الزرد عينات الملون بواسطة جبل الجامعة<em&gt; في الوضع الطبيعي</em&gt; التهجين

يعتبر سمك الزرد نظاما نموذجيا ممتازا للدراسات الجينية والتنموية. زرع الخرزة هو تقنية قيمة لمعالجة الأنسجة يمكن استخدامها لاستجواب آليات النمو عن طريق إدخال تغييرات في البيئات الخلوية المحلية. يصف هذا البروتوكول كيفية إجراء زرع الميكروبيدات في جنين الزرد.

Microbead زرع الأجنة الزرد

والهدف من هذا البروتوكول لتغيير بينيترانسي لقاتله تعمل متحولة الهيكل العظمى في الزرد بالانتقاء الوراثي. طفرات قاتلة لا يمكن أن ينمو إلى مرحلة البلوغ، وولدت أنفسهم، ولذلك يصف هذا البروتوكول وسيلة لتتبع وتحديد penetrance عبر أجيال متعددة من ذرية الاختبار.

تحويل الزرد الفتاكة Penetrance متحولة الهيكل العظمى بذرية اختبار

هنا، نحن تصف 3 نماذج الإصابة الزرد الكبار واستخدامها مجتمعة مع العلاج بالعقاقير المثبطة للمناعة. نقدم التوجيه على تصوير لتجديد الأنسجة وكشف تمعدن العظام فيه.

نماذج الإصابة الزرد الكبار دراسة آثار البردنيزولون في تجديد أنسجة العظام

قمنا بتعديل نموذج انخفاض الوزن Marmarou لسمك الحمار الوحشي الكبار لفحص اتساع نطاق الأمراض بعد إصابات الدماغ الرضية القوة الحادة (TBI) والآليات الكامنة وراء تجديد الخلايا العصبية اللاحقة. هذا النموذج TBI قوة حادة قابلة للتطوير، ويحفز TBI خفيفة، معتدلة، أو شديدة، ويستعرض عدم التجانس الإصابة لوحظ في TBI الإنسان.

نموذج قابل للتطوير لدراسة آثار إصابة القوة الحادة في سمك الحمار الوحشي البالغ

يصف هذا البروتوكول حصاد وتصور قشور الزرد أثناء التجديد في الجسم الحي . بالإضافة إلى ذلك ، يتم تقديم ثقافة خارج الجسم الحي لهذه المقاييس لمدة تصل إلى 7 أيام بعد الحصاد.

تجديد قشور الزرد في ثقافة المقاييس توتو وخارج الجسم الحي

يقدم هذا البروتوكول طريقة لدراسة الديناميكيات الخلوية باستخدام تقنية بسيطة للثقافة في المختبر . يوفر فرصة للباحثين والمعلمين في أسماك الزرد لدراسة العمليات الخلوية ، مثل تلك المتعلقة بتوازن العظام وبيولوجيا الخلية الأساسية ، من خلال تصور النوى الفلورية والخلايا المبرمج داخل المقاييس.

تقنية الاستزراع في المختبر لدراسة الديناميكيات الخلوية في قشور أسماك الزرد

يقدم البروتوكول الموصوف هنا إجراء بسيطا وسهل المتابعة لتلطيخ وتشريح الغضاريف القحفية الوجهية في يرقة سمك الزرد البالغة من العمر 5 أيام. يمكن استخدامه لدراسة تشريح وشكل وحجم هذه الهياكل في ظل ظروف النمو المختلفة.

تشريح الأنسجة القحفية الوجهية لسمك الزرد عند تلطيخها باللون الأزرق ألسي

يصف هذا العمل بروتوكولا لقياس شكل الغضروف الجمجمي الوجهي باستخدام برامج حرة (tpsDigs2، MorphoJ، وPAST) لقياس التغيرات في بنية الوجه في يرقات سمك الزرد.

تحليلات مورفومترية للشكل: صندوق أدوات برنامج التحليل لقياس شكل الجمجمة الوجهية في سمك الزرد

اكتشف تحليل العناصر المحدودة لمحاكاة البيئة الميكانيكية لفك سمك الزرد النامي. تساعد هذه الطريقة الباحثين على دراسة تأثير الأحمال الميكانيكية على سلوك الخلايا والتعبير الجيني.

بناء نماذج العناصر المحدودة المعنية بالتحقيق في الزرد الفك الميكانيكا الحيوية

استكشف المزيد من الفيديوهات