تحديد بين الخلايا اشارة الأحداث المستحثة في خلايا قابلة للحياة من خلال التفاعل مع المجاورة الخلايا التي تمر أفكارك موت الخلية

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحديد أحداث الإشارات المستحثة والخلايا المستجيبة القابلة للحياة بعد تفاعلها الجسدي مع الخلايا الميتة القريبة. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجالات بيولوجيا الخلية وعلم الأمراض وعلم وظائف الأعضاء مثل التأثير الذي تمارسه الخلايا الميتة أو المحتضرة على جيرانها الأحياء. تتمثل المزايا الرئيسية لهذه التقنية في أنها مباشرة وغير مكلفة ، وأنه يمكن تطبيقها لدراسة التأثيرات البيولوجية المستحثة في الخلايا الحية بعد تفاعلها مع الخلايا المجاورة التي تخضع لموت الخلايا المبرمج.

سيظهر هذه التقنية Lanfei Feng ، فني في مختبري. لبدء هذا الإجراء بعد تمرير خلايا BUNPT إلى أطباق زراعة الأنسجة المعالجة بالغاز المفرغ بالبلازما 100 ملم ، قم بزراعتها في وسط الثقافة A إلى التقاء وترطيب الغلاف الجوي لثاني أكسيد الكربون بنسبة 5٪ عند 37 درجة مئوية. بعد ذلك ، اشطف الطبقة الأحادية للخلية الملتصقة ثلاث مرات باستخدام وسط الثقافة B. ثم قم بتحفيز موت الخلايا المبرمج عن طريق احتضان الخلايا في وسط الثقافة B ، الذي يحتوي على staurosporine ، وهو مثبط لبروتين كيناز غير انتقائي ، لمدة 3 ساعات عند 37 درجة مئوية.

بعد 3 ساعات ، اجمع الوسط الذي يحتوي على خلايا موت الخلايا المبرمج العائمة التي انفصلت عن الطبقة الأحادية. بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي لهذا الوسيط لمدة عشر دقائق عند 500 مرة G.بعد ذلك ، تخلص من المادة الطافية ، واغسل الحبيبات ثلاث مرات بوسط الثقافة B ، قبل إضافتها مرة أخرى إلى الخلايا الملتصقة. بعد خطوة الغسيل هذه ، افصل الخلايا الملتصقة المتبقية عن طريق إضافة 5 مللي مولار EDTA في 1X DPBS خال من الكالسيوم والمغنيسيوم.

اجمع الوسط الذي يحتوي على خلايا موت الخلايا المبرمج المنفصلة وضع الخلايا المنفصلة مع الخلايا موت الخلايا المبرمج العائمة في أنبوب طرد مركزي معقم من البوليسترين سعة 15 مل. ثم اغسل الخلايا المبرمجة ثلاث مرات عن طريق الطرد المركزي لمدة عشر دقائق عند 500 × G.Aftered في عشرة ملليلتر من 1X الكالسيوم وDPBS الخالي من المغنيسيوم لكل غسلة. بعد الغسيل الأخير ، قم بتعليق الخلايا المبرمجة في وسط مزرعة طازجة B عند 5 × 10 ^ 6 خلايا لكل مليلتر ، قبل استخدامها لتحفيز الخلايا المستجيبة.

بدلا من ذلك ، قم بإصلاح الخلايا المبرمج المغسولة في 0.4 بارافورمالدهيد في 1X DPBS لمدة 30 دقيقة ، ثم اغسلها ثلاث مرات بوسط الثقافة B ، وعلقها فيها عند 5 × 10 ^ 6 خلايا لكل مليلتر قبل استخدامها لتحفيز الخلايا المستجيبة. بعد تمرير خلايا BUNPT إلى أطباق زراعة الأنسجة المعالجة بغاز البوليسترين المفرغ المعقم بقطر 100 ملم ، قم بزراعتها إلى التقاء وترطيب الغلاف الجوي لثاني أكسيد الكربون بنسبة 5٪ في ظل ظروف متساهلة. ثم اشطف طبقة أحادية الخلية الملتصقة ثلاث مرات ب 10 مل من وسط المزرعة B لكل شطف.

بعد ذلك ، افصل الخلايا عن طريق إضافة 5 ملي مولار EDTA في 1X الكالسيوم وDPBS الخالي من المغنيسيوم. اجمع الخلايا المنفصلة من الوسط المحتوي على EDTA وأضف معلق الخلية إلى أنبوب طرد مركزي معقم سعة 15 مل. بعد ذلك ، اغسل الخلايا ثلاث مرات عن طريق الطرد المركزي لمدة عشر دقائق عند 500 مرة جم وأعد التعليق في 10 مل من DPBS الخالي من الكالسيوم والمغنيسيوم لكل غسلة.

بعد الغسيل الأخير ، قم بتعليق الخلايا في وسط الثقافة الطازجة B عند 5 × 10 ^ 6 خلايا لكل مليلتر. بعد ذلك ، قم بتحفيز النخر عن طريق تسخين الخلايا إلى 70 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة في حمام مائي ، مع دوامة تعليق الخلية هذا برفق كل عشر دقائق. بعد تحريض النخر ، احتضان الخلايا لمدة ساعتين في جو مرطب بنسبة 5٪ من ثاني أكسيد الكربون عند 37 درجة مئوية ، وقم بدوامة تعليق الخلية برفق كل 15 دقيقة.

في هذا الإجراء ، قم بزراعة خلايا BUNPT في أطباق زراعة الأنسجة المعقمة 100 ملم في ظل ظروف متساهلة ، حتى تحقق حوالي 85٪ من التقاء. بعد ذلك ، قم بشفط وسط الثقافة A وشطف الخلايا ثلاث مرات ب 10 مل من وسط الثقافة B لكل شطف. بعد ذلك ، يقوم المصل بتجويع الخلايا في وسط الثقافة B لمدة 18 إلى 24 ساعة في جو مرطب بنسبة 5٪ من ثاني أكسيد الكربون في ظل ظروف غير متساهلة ، من أجل تحفيز الهدوء.

قم بتسمية طبق منفصل لزراعة الأنسجة لخلايا BUNPT المتقاربة للشروط التجريبية الستة للإجراء التالي. الآن ، استنشق وسط الثقافة B من الأطباق المسماة مسبقا لخلايا مستجيب BUNPT الهادئة. لتحضير أطباق 100 ملم في ظروف مختلفة ، أضف مللي من أي من وسط المزرعة B بدون خلايا ، أو تعليق الخلايا المبرمج عند 5 × 10 ^ 6 خلايا لكل مليلتر في وسط الثقافة B ، أو تعليق الخلية الميتة عند 5 × 10 ^ 6 خلايا لكل مل في وسط الثقافة ب ، حقق نسبة الخلايا الميتة إلى المستجيبة من واحد إلى واحد عن طريق إضافة مل من الخلايا الميتة عند 5 × 10 ^ 6 خلايا لكل مليلتر إلى أ طبق متقارب 100 ملم ، يحتوي على 10X10 ^ 6 خلايا.

حرك الأطباق برفق. ثم احتضنها عند 37 درجة مئوية في الغلاف الجوي المرطب بنسبة 5٪ من ثاني أكسيد الكربون. بعد 30 دقيقة ، قم بتحفيز خلايا المستجيب إما بمركبة أو 15 nMOL EGF ، وفقا للوضع المسبق على طبق الثقافة.

احتضان الخلايا لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية في جو مرطب بنسبة 5٪ من ثاني أكسيد الكربون. بعد ذلك ، اغسل الخلايا الميتة بإضافة خمسة ملليمترات من DPBS المثلج. حرك الطبق وشفط سائل الغسيل.

كرر الغسيل ثلاث مرات. ثم ضع أطباق الخلية المستجيبة على الفور على الجليد لمزيد من المعالجة. يوضح هذا الشكل أن تعرض مستجيبي BUNPT الهادئين لخلايا موت الخلايا المبرمج لمدة 30 دقيقة يثبط بقوة الفسفرة القاعدية ل GSK3 alpha beta.

لمنع التفاعل الجسدي بين مستجيبي BUNPT والخلايا المبرمجة ، تمت زراعة مستجيبي BUNPT في نظام دعم قابل للاختراق ، وتم فصلهم عن أهداف موت الخلايا المبرمج بواسطة غشاء بولي كربونات 0.4 ميكرون. ألغى منع التفاعل الجسدي بين مستجيبي BUNPT والخلايا موت الخلايا المبرمج قدرة أهداف موت الخلايا المبرمج على تثبيط فسفرة GSK3 ألفا بيتا. لتقييم دور البلعمة ، تم استخدام مثبط الهيكل الخلوي Cytochalasin D لمنع امتصاص البلعمة للخلايا الميتة.

تثبيط فسفرة GSK3 ألفا بيتا استجابة للخلايا موت الخلايا المبرمج في غياب البلعمة. بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء هذه التقنية في غضون 4-6 ساعات إذا تم إجراؤها بشكل صحيح ، باستثناء الوقت اللازم للرحلان الكهربائي للهلام والنشاف المناعي. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر أن استخدام التعليق الخلوي بدلا من الترابط القابل للذوبان كمحفز يطرح العديد من العقبات التجريبية المتأصلة والتي لا مفر منها إلى حد كبير.

باستخدام نفس الإجراء ، يمكن للمرء دراسة وظائف الخلية الأخرى ، مثل البقاء على قيد الحياة أو التكاثر أو نمو الخلايا من أجل تحديد العواقب الوظيفية لأحداث الإشارات التي يتم إحداثها في الخلايا المستجيبة الحية بعد تفاعلها مع الخلايا الميتة القريبة. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحديد أحداث إشارات محددة يتم إحداثها في خلايا المستجيبة القابلة للحياة بعد تفاعلها الجسدي مع الخلايا الميتة القريبة.