خلية واحدة من الحمض النووي الريبي-سيك من مجموعات فرعية محددة من خلايا العقدة الشبكية

الهدف العام من هذا الإجراء هو عزل الخلايا المفردة المصنفة بالفلورسنت من شبكية العين الحية الكاملة. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في علم الأعصاب. مثل كم عدد الأنواع الفرعية لفئة عصبية معينة موجودة وما هي العلامات الجينية لكل نوع فرعي؟

الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أننا نتخلى عن الحاجة إلى تفكك أنسجة الشبكية ، مما يسمح للخلايا بالبقاء على قيد الحياة في بيئة أكثر صحة قبل العزلة. تمتد الآثار المترتبة على هذه التقنية إلى أي مجموعة خلايا مصنفة بالفلورسنت ، وبالتالي يمكن تطبيقها على أنظمة أخرى لفهم التنوع الخلوي ووظيفته في الصحة والمرض. بشكل عام ، سيكافح الأفراد الجدد في هذه الطريقة ، لأن هذه التقنية تعتمد على قدرة الباحث على تثبيت الخلية دون المساس بصلاحية الخلية.

العرض المستقبلي لهذه الطريقة أمرا بالغ الأهمية حيث قد يكون من الصعب تعلم خطوات عزل الحمض النووي الريبي ، لأن الكمية الصغيرة من الحمض النووي الريبي قد تتحلل بسهولة إذا لم يتم التعامل معها بشكل صحيح وسريع. لبدء هذا الإجراء ، قم بوخز القرنية بإبرة وقطعها بعيدا عند حدود القرنية والصلبة. ثم قم بإزالة العدسة باستخدام الملقط.

قم بعمل تمزق برفق في الصلبة وقطع العصب البصري حيث تلتقي شبكية العين والصلبة. قم بإنهاء إزالة الصلبة من شبكية العين بعناية. بعد ذلك ، قم بإزالة الجسم الزجاجي الشفاف.

قطعي شبكية العين إلى نصفين واحفظيها في محلول مؤكسج خارج الخلية في درجة حرارة الغرفة حتى الاستخدام. عندما تكون جاهزا لتركيب الأنسجة في غرفة التسجيل ، انقل قطعة من شبكية العين إلى محلول الإنزيم ، مخففة في 500 ميكرولتر من محلول خارج الخلية المؤكسج في طبق بتري ، واحتضانها لمدة دقيقتين في درجة حرارة الغرفة على شاكر. بعد ذلك ، اغسل شبكية العين في محلول خارج الخلية المؤكسج وانقلها إلى غرفة تسجيل ذات قاع زجاجي باستخدام ماصة نقل بلاستيكية.

بعد ذلك ، استخدم الملقط لتسطيح الأنسجة بعناية بحيث تكون طبقة المستقبلات الضوئية متجهة لأسفل. قم بإزالة السوائل الزائدة باستخدام ماصة وثبت الأنسجة باستخدام حلقة بلاتينية بشبكة من النايلون. بعد ذلك ، املأ الغرفة بالمحلول المؤكسج خارج الخلية وقم بتثبيتها على مرحلة المجهر.

قم بتنقية الأنسجة بالمحلول المؤكسج خارج الخلية بسرعة اثنين إلى أربعة ملليلتر في الدقيقة. للتحضير لهذا الإجراء، قم بنبض بعض الماصات الدقيقة الزجاجية للتسجيلات الفيزيولوجية الكهربية باستخدام مجتذب ماصات دقيقة. راقب طبقة الخلايا العقدية باستخدام بصريات IR-DIC.

بعد ذلك ، حدد GFP بالإضافة إلى الخلايا العقدية باستخدام التألق عند حوالي 480 نانومتر. بعد ذلك ، حدد موقع الماصة المملوءة بمحلول داخل الخلايا في DIC. قم بتطبيق ضغط إيجابي طفيف وصفر أي إزاحة للجهد على مكبر الصوت.

بعد ذلك ، قم بخفض الماصة الدقيقة الزجاجية على خلية موجبة GFP وقم بتطبيق خطوات أمر جهد الاختبار لمراقبة مقاومة مانع التسرب. يجب أن يشكل الضغط السلبي ختما جيجا أوم بين الماصة وغشاء الخلية. بعد تشكيل ختم مستقر ، قم بتمزيق الغشاء عن طريق تطبيق نبضات قصيرة من الضغط السلبي للوصول إلى الخلية بأكملها.

انتظر من دقيقة إلى دقيقتين حتى تمتلئ تشعبات الخلية بتتبع الفلورسنت. في هذه الخطوة ، استخرج بعناية محتوى الخلية السيتوبلازمية في الماصة عن طريق الضغط السلبي باستخدام حقنة عشرة ملليلتر. في غضون ذلك ، راقب الاستخراج في DIC من خلال تصور حجم جسم الخلية.

بعد استخراج المحتويات السيتوبلازمية، ارفع الماصة بعناية من الأنسجة وقم بإزالة الماصة بسرعة من المحلول. بعد ذلك، قم بإزالة الماصة بسرعة من حامل الرأس واشطف طرف الماصة لفترة وجيزة باستخدام H2O المعالج ب DEPC. بعد ذلك، قم بتوصيل الماصة بحقنة سعة مليلتر واحد عبر الأنبوب المحكم.

طرد الخلايا على الفور إلى عشرة ميكرولتر من المخزن المؤقت للتحلل واحد في أنابيب PCR سعة 0.2 ملليلتر. قم بالطرد المركزي للأنابيب لفترة وجيزة في جهاز طرد مركزي صغير على سطح الطاولة عند 2000 مرة جم لمدة عشر ثوان. بعد ذلك ، قم بتجميد العينات على الفور على الثلج الجاف لمدة خمس دقائق.

بعد التجميد ، قم بتخزينها عند سالب 80 درجة مئوية لمدة تصل إلى أسبوعين للحصول على أفضل النتائج. للتحضير لهذا الإجراء ، قم بإعداد جهاز فاصل مغناطيسي عن طريق لصق الجزء العلوي من حامل طرف P20 أو P200 المقلوب على الحامل المغناطيسي 96 بئر. ثم قم بإعداد 70٪ من الإيثانول الطازج بحوالي مليلتر واحد لكل عينة.

قم بإزالة حبات الحمض النووي الريبي المغناطيسية من تخزين 4 درجات مئوية وقم بإذابة الثلج في درجة حرارة الغرفة. بمجرد أن تصبح حبات الحمض النووي الريبي في درجة حرارة الغرفة ، قم بدوارها لمدة 30 ثانية للتأكد من خلط المحلول جيدا. بعد ذلك ، قم بإذابة الخلايا في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقة واحدة.

بعد ذلك، أضف خمسة ميكرولترات من H2O الخالي من الريناز إلى كل عينة والماصة لأعلى ولأسفل. بعد ذلك ، أضف 22 ميكرولترا من حبات الحمض النووي الريبي إلى كل أنبوب واخلطها جيدا. احتضان العينات في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق للسماح للحمض النووي الريبي بالتفاعل والارتباط بالخرز المغناطيسي.

بعد ذلك ، ضع الأنابيب على جهاز فاصل مغناطيسي لمدة ثماني دقائق. قبل المتابعة ، تأكد من أن المادة الطافية واضحة. راقب الخرزات من لوحة واحدة وتأكد من عدم فصلها عن جانب الأنبوب أثناء سحب العينات.

قم بإزالة المادة الطافية من العينات وأضف 150 ميكرولتر من 70٪ من الإيثانول. ثم قم بإزالة الإيثانول وكرر الغسيل مرتين أخريين. اترك العينات تجف في الهواء لمدة ست دقائق.

تحقق بشكل متقطع لمعرفة ما إذا كان قد تم جمع المزيد من الإيثانول في قاع الأنبوب وقم بإزالته وفقا لذلك. تذكر أنه من الأهمية بمكان تجفيف الخرز بشكل مناسب. إذا لم تكن الخرزات جافة بدرجة كافية ، فقد يتم نقل الإيثانول مع المادة المزيلة وسيقلل من إجمالي الغلة ، بينما يمكن أن يؤدي الخرز المجفف إلى فقدان الحمض النووي الريبي.

أثناء تجفيف العينات ، قم بإعداد مخزن مؤقت للتفاعل 10x عن طريق الجمع بين 19 ميكرولترا من محلول التحلل اثنين وميكرولتر واحد من مثبط Rnase. قم بتدويرها لفترة وجيزة واحتفظ بها على الجليد. بمجرد أن تجف العينات ولم تظهر كريات الخرز لامعة ، قم بإزالة الأنابيب من الفاصل المغناطيسي وأضف 9.5 ميكرولتر من H2O الخالي من الرنسيز لإعادة ترطيب العينات.

بعد ذلك ، ضع العينات على الجليد وأضف ميكرولتر واحد من محلول تفاعل 10x إلى كل عينة. تظهر هذه الصورة طبقة الخلية العقدية في شبكية العين ، والتي يتم تصورها باستخدام IR-DIC في مستحضر شبكية العين بالكامل. تم تصور نفس المستحضر في التألق عند حوالي 480 نانومتر لتحديد الخلايا العقدية الإيجابية GFP.

تظهر هذه الصورة خلية إيجابية GFP تم استهدافها لتسجيل مشبك التصحيح وملؤة بتتبع الفلورسنت. تسمح الصورة متحدة البؤر لتشعبات ipRGC المصورة في الجزء السفلي من طبقة الضفيرة الداخلية وإيقاف تشغيلها بتصنيف أنواع الخلايا هذه يظهر إخراج المحلل الحيوي هذا أمثلة على المكتبات التي خضعت للنسخ العكسي والتضخيم والتنقية. تظهر الممرات من الأول إلى الثالث مسحات الحمض النووي المثالية ، بينما يمثل الممر الرابع عينة سيئة المعالجة.

يجب أن يحتوي حارة التحكم على قمتين نظيفتين بأحجام علامات 35 نقطة أساس و 10380 نقطة أساس. فيما يلي أثر مفصل لمكتبة واحدة تم إعدادها بنجاح بكثافة عالية تبلغ حوالي 2 كيلو بايت. يوضح هذا التتبع أيضا التحضير الناجح ، ولكن مع تركيز اللطاخة حول 500 نقطة أساس.

توضح هذه الصورة إخراج المحلل الحيوي بعد وضع العلامات على العينات وتضخيمها وتنقيتها. يمكن رؤية التتبع التفصيلي لعينة تم وضع علامات عليها بنجاح هنا ، بما يتوافق مع العينة في الممر الأول. سيؤدي وضع العلامات غير المكتمل إلى أثر مثل الأثر الذي يظهر هنا ، مما يستدعي إعادة الوسم مع تخفيف جديد.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية عزل الحمض النووي الريبي عن أنواع الخلايا المصنفة فلورسنت في شبكية العين السليمة. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر أن الحمض النووي الريبي حساس جدا للتدهور وأن وجود خلايا شبكية سليمة هو المفتاح. بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء هذه التقنية في غضون يومين إذا تم إجراؤها بشكل صحيح.

باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل qPCR أو تهجين NC2 أو الكيمياء المناعية من أجل الإجابة على أسئلة إضافية ، مثل ما إذا كانت الجينات المحددة خاصة بنوع فرعي خلوي معين. مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال علم الأعصاب ، في محاولة لفهم عدم تجانس الخلايا العصبية في مناطق مختلفة من الدماغ. سيسمح فهم هذا عدم التجانس بإجراء دراسات مستقبلية للوظيفة الخلوية والاتصال في المجموعات السكانية المحددة جزيئيا.