Fat Body Organ Culture System in <em>Aedes Aegypti</em>, a Vector of Zika Virus

Hae-Na Chung; Stacy D. Rodriguez; Victoria K. Carpenter; Julia Vulcan; C. Donovan Bailey; Madhugiri Nageswara-Rao; Yiyi Li; Geoffrey M. Attardo; Immo A. Hansen

doi:10.3791/55508

الجسم الدهون نظام الثقافة الجهاز في بعوض الزاعجة المصرية، ناقل للفيروس Zika

JoVE Journal
Biology
Author Produced

This content is Free Access.

JoVE Journal Biology

Fat Body Organ Culture System in Aedes Aegypti, a Vector of Zika Virus

الجسم الدهون نظام الثقافة الجهاز في بعوض الزاعجة المصرية، ناقل للفيروس Zika

Full Text

10,111 Views

06:18 min

August 19, 2017

DOI: 10.3791/55508-v

Hae-Na Chung¹, Stacy D. Rodriguez¹, Victoria K. Carpenter², Julia Vulcan¹, C. Donovan Bailey¹, Madhugiri Nageswara-Rao¹, Yiyi Li³, Geoffrey M. Attardo⁴, Immo A. Hansen^1,5

¹Department of Biology,New Mexico State University, ²Department of Molecular Genetics and Microbiology,Duke University, ³Department of Computer Sciences,New Mexico State University, ⁴Department of Epidemiology of Microbial Diseases,Yale School of Public Health, ⁵Institute of Applied Biosciences,New Mexico State University

Please note that some of the translations on this page are AI generated. Click here for the English version.

Overview

The fat body is a crucial metabolic organ in insects, analogous to liver and fat tissues in vertebrates. This article presents a live organ culture system for studying the responses of isolated mosquito fat body tissue to various stimuli.

Key Study Components

Area of Science

Neuroscience
Metabolism
Insect Physiology

Background

The mosquito fat body is essential for metabolic processes.
It serves as the primary source of yolk proteins in mosquitoes.
This study focuses on the yellow fever mosquito, Aedes aegypti.
The fat body culture system allows for in-depth physiological studies.

Purpose of Study

To demonstrate an in vitro organ culture system for mosquito fat bodies.
To explore the regulation of yolk protein production.
To investigate nutrient uptake mechanisms in Aedes aegypti.

Methods Used

Preparation of solutions and reagents for fat body culture.
Dissection of mosquitoes to isolate fat bodies.
Transfer of isolated fat bodies to an amino acid-enriched medium.
Subsequent analyses including RNA-seq and gene expression studies.

Main Results

Identification of gene expression changes in response to stimulation.
Demonstration of yolk protein gene activation in cultured fat bodies.
Comparison of unstimulated and stimulated fat body samples.
Results indicate significant changes in gene expression levels.

Conclusions

The fat body culture system is effective for studying insect metabolism.
Stimulation with amino acids and ecdysone enhances yolk protein synthesis.
This method provides insights into metabolic regulation in mosquitoes.

Frequently Asked Questions

What is the fat body in mosquitoes?

The fat body is a metabolic organ in insects that functions similarly to the liver and fat tissues in vertebrates.

How is the fat body culture system set up?

The system involves preparing solutions, isolating fat bodies through dissection, and transferring them to a nutrient-rich medium.

What are the applications of this fat body culture system?

It can be used for studying yolk protein production, nutrient uptake, and various downstream analyses like RNA-seq.

What stimuli are used to activate fat body metabolism?

Amino acids and the insect steroid hormone 20-hydroxyecdysone are used to stimulate yolk protein synthesis.

What results were observed in the study?

Significant changes in gene expression were noted between unstimulated and stimulated fat body samples.

الجسم الدهون هو الجهاز المركزي الأيضي في الحشرات. نقدم نظام جهاز يعيش ثقافة التي تمكن المستخدم من دراسة ردود أنسجة الجسم الدهون منعزلة للمنبهات المختلفة.

مرحبا ، اسمي إيمو هانسن ، من مختبر فسيولوجيا النواقل الجزيئية في جامعة ولاية نيو مكسيكو. نظام زراعة الجسم لدهون البعوض الذي سنعرضه اليوم هو نظام زراعة الأعضاء في المختبر الذي نستخدمه في مختبرنا لدراسة علم وظائف الأعضاء والتمثيل الغذائي لأنسجة الجسم الدهنية الحية المرتبطة بجدران جسم البطن للبعوض. جسم دهون الحشرات هو عضو تحدث فيه العديد من عمليات التمثيل الغذائي.

تعكس وظائفه وظائف أنسجة الكبد والدهنية في الفقاريات. لقد استخدمنا هذا النظام لدراسة تنظيم إنتاج بروتين الصفار وآليات امتصاص المغذيات في بعوضة الحمى الصفراء ، الزاعجة المصرية. الزاعجة المصرية هي ناقل رئيسي للفيروس المفصلي مثل حمى الضنك والشيكونغونيا وزيكا

الجسم الدهني للبعوض هو المصدر الوحيد لبروتينات صفار البيض في البعوض. يوضح بروتوكول الفيديو هذا نظام زراعة الجسم لدهون البعوض في المختبر ويعرض العديد من التطبيقات التجريبية للنظام. تم إعداد البروتوكول الذي سنعرضه في أجزاء متعددة.

أولا ، سنقوم بإعداد الحلول والكواشف اللازمة لنظام زراعة الجسم الدهني. ثانيا ، سنقوم بتشريح البعوض لعزل الأجسام الدهنية. بعد ذلك ، آخر شيء ، سنقوم بنقل الأجسام الدهنية المعزولة إلى وسط غني بالأحماض الأمينية لتنشيط تخليق بروتين الصفار.

هناك العديد من التطبيقات النهائية التي يمكن إجراؤها بعد زراعة الجسم الدهني. سنقوم اليوم بإجراء ثقافة الجسم الدهنية متبوعة بتسلسل الجيل التالي. سنقارن عينتين ، عينة غير محفزة مع عينة واحدة محفزة بالأحماض الأمينية والإكديسون.

تشمل المواد والمعدات الإضافية التي ستكون مطلوبة شفاطة مع قارورة تجميع لجمع البعوض ، وسادة ذبابة CO2 موصولة بزجاجة غاز CO2 ، والإيثانول لتنظيف وسادة الذبابة ، ومجهر ستيريو مع مصدر الضوء ، ومقص تشريح صغير ، وملاقط ذات رؤوس دقيقة ، و 96 لوحة بئر. للتحضير لزراعة الجسم الدهني ، يجب تحضير ثلاثة محاليل وكواشف ، محلول المخزون الأميني ، ومحلول المخزون الملحي الفسيولوجي للزاعجة ، ومحلول مخزون الكالسيوم. يتم الجمع بين محلول المخزون الملحي الفسيولوجي الزاعجة ومحلول مخزون الكالسيوم لصنع وسائط زراعة الجسم الدهني.

يجب أن يكون عمر البعوض المستخدم في هذه التجربة ثلاثة أيام على الأقل بعد ظهوره. باستخدام شفاط يعمل بالبطارية ، اجمع البعوض في قارورة تجميع. ضع قارورة التجميع مع عينتك على وسادة CO2 لتخدير البعوض.

بدلا من ذلك ، يمكن استخدام الثلج لتخدير البعوض. تخلص من جميع الذكور قبل البدء في التشريح. قم أولا بتركيز مجهر التشريح باستخدام بعوضة اختبار لضمان الرؤية.

بمجرد تركيز المجهر ، ضع شريحة مقعرة على المجهر وضع قطرتين من APS في المنتصف. APS يساعد في الحفاظ على ارتفاع البعوض وفي جمع أعضاء البعوض المختلفة. حدد البعوض بالملقط ، والتقط البعوض من الساقين.

انزع الساقين. أثناء إمساك البعوضة من الصدر بيدك اليسرى ، استخدم الملقط الآخر للإمساك بالبعوضة من آخر جزأين أو ثلاثة أجزاء من البطن واسحبها برفق لإزالتها. يجب أن يزيل هذا الإجراء المبايض والأنابيب المالبيجي والأمعاء الخلفية والأمعاء الوسطى والمحصول.

بمجرد إزالة الأعضاء ، استخدم مقص الزنبرك لإنهاء تشريح الجسم الدهني. أدخل شفرة واحدة في الفتحة التي تم إنشاؤها من إزالة آخر جزأين إلى ثلاثة أجزاء من البطن واقطع البطن بالطول حتى يصل إلى الجزء الموجود أسفل الصدر. بعد الشق ، يجب أن يتوسع البطن إلى الخارج.

يتم إجراء شق آخر بشكل جانبي عبر الجزء العلوي من البطن حيث انتهى الشق الأول. بعد الشقوق ، ينفتح البطن ويطفو مع جانب البشرة لأعلى والأجسام الدهنية التي تستريح داخل APS. بمجرد أن تتوازن الأجسام الدهنية على محلول APS لمدة نصف ساعة على الأقل ، يمكن بعد ذلك نقلها إلى وسائط زراعة الجسم الدهني.

من أجل تحفيز الأجسام الدهنية على البدء في التعبير الجيني لبروتين الصفار ، نقوم بنقلها إلى وسط يحتوي على مستويات عالية من الأحماض الأمينية الحرة وهرمون الستيرويد الحشري ، 20-hydroxyecdysone. بمجرد نقلها ، يتم تحضين الأجسام الدهنية لمدة ست ساعات في وسائل الإعلام. بعد فترة الحضانة ، يتم نقل الأجسام الدهنية إلى أنبوب eppendorf مع مخزن مؤقت مناسب للتحليلات المطلوبة.

اعتمادا على الهدف التجريبي ، يمكن استخدام الأجسام الدهنية في العديد من البروتوكولات اللاحقة مثل qPCR أو البقع الغربية أو البروتينات أو التمثيل الغذائي أو تسلسل الحمض النووي الريبي. على سبيل المثال ، أجرينا تجربة زراعة الجسم الدهني وحفزنا الأجسام الدهنية المعزولة عن طريق احتضانها على محلول يحتوي على خليط متوازن من جميع الأحماض الأمينية ال 20 التي تحدث بشكل طبيعي وهرمون الستيرويد الحشري 20-هيدروكسي أكديزون لمدة ست ساعات حيث تم تحضين الأجسام الدهنية الضابطة على PS لفترة متساوية من الوقت. يوضح هذا الشكل نتائج تحليل تسلسل الحمض النووي الريبي لتجربتنا.

تشير الخريطة الحرارية إلى مستويات التعبير الجيني ل 1256 جينا يتم التعبير عنها في أجسام الدهون المستنبتة تحت علاجين مختلفين. لقد غيرت كل هذه الجينات بشكل كبير مستويات التعبير بين العلاجين. يوضح هذا الجدول الجينات العشرة الأكثر تنظيما بعد تنشيط الأجسام الدهنية المستنبتة بالأحماض الأمينية و 20-هيدروكسي أكديسون.

كما هو متوقع ، فإن معظم هذه الجينات هي جينات بروتين صفار البيض. شكرا لك على اهتمامك بثقافة الجسم لدهون البعوض.