سوببيال الغدة المرتبطة فيروس 9 (AAV9) ناقلات تسليم في الفئران الكبار

الهدف العام من تقنية توصيل AAV9 تحت الظهر هو تحقيق تعبير قوي للجينات المتني الشوكي على طول الوتر الشوكي بالكامل في الفئران البالغة. يمكن أن تسهل هذه الطريقة الدراسات التي تستهدف معالجة التعبير الجيني للعمود الفقري وتساعد في فهم آلية العديد من الاضطرابات التنكسية العصبية الشوكية بما في ذلك التصلب الجانبي الضموري أو إصابة العمود الفقري الرضحية أو الألم المزمن. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أن التعبير الجيني المعدل وراثيا عالي القوة يتم تحقيقه من خلال المادة الرمادية والبيضاء الشوكية في أجزاء متعددة من العمود الفقري ، والتي تجاور الجزء المحقون تحت الضلع AAV9.

العرض المرئي لهذه الطريقة أمرا بالغ الأهمية لأنه يصعب تعلم خطوة فتح الجافية ووضع الإبرة تحت الظهر بدون عرض مرئي. سيوضح هذا الإجراء تاكاهيرو تادوكورو ، زميل ما بعد الدكتوراه في مختبرنا. ابدأ بتخدير بشكل صحيح للجراحة ، يتم استخدام الأيزوفلوران هنا.

تأكد من عدم وجود استجابة لقرصة المخلب قبل المتابعة ، ثم قم بتغطية العينين بمرهم العين. بعد ذلك ، احلق الجزء الخلفي من باستخدام المقص ونظف الجلد باستخدام 2٪ كلورهيكسيدين. إذا كان سيتم إجراء الحقن تحت الظهر القطني ، فقم بقص الجلد الذي يغطي الفقرات T8 إلى L1 بمشرط ثم استخدم المقص لفصل العضلة المجاورة للفقرات من الفقرات الشوكية T10 إلى T12.

قم بتركيب في إطار تجسيمي قياسي ، باستخدام مشابك العمود الفقري للفأر. بعد ذلك ، استخدم مثقاب الأسنان لحلق جانبي الصفيحة من الفقرات T10 إلى T12 حتى تظهر تشققات ثم استخدم الملقط لإزالة شظايا العظام المتشققة وفضح السطح الظهري للوتر الشوكي القطني. أصبحت الجافية مرئية الآن ، استخدم إبرة من الفولاذ المقاوم للصدأ عيار 30 لعمل شق من واحد إلى ملليمترين في الجافية.

من المهم قطع الجافية بعناية لتجنب إصابة غشاء البي الأساسي. الآن ، أمسك حافة الجافية المقطوعة بالملقط وقم بتمديد فتحة الجافية حتى خمسة ملليمترات. إذا كان سيتم إجراء حقن تحت عنق الرحم ، فقم بتثبيت رأس الفأر عن طريق وضع الرأس في إطار تجسيمي باستخدام قضبان الأذن واستخدم المقص لعمل شق من 1.5 إلى سنتيمترين في جلد الرقبة الظهرية لفضح الأجزاء C1 و C2 والعظم القذالي.

بعد ذلك ، احلق جزءا من العظم القذالي المكشوف باستخدام مثقاب الأسنان وقم بإزالة شظايا العظام باستخدام الملقط. بعد ذلك ، استخدم إبرة وملقط من الفولاذ المقاوم للصدأ عيار 23 لإزالة الغشاء القذالي atlanto لصهريج ماجنا. استخدم مسحات قطنية لتنظيف موقع الشق من أي أنسجة وبقايا عظمية ، ثم افتح الجافية ، وقم بعمل شق من ملليمترين إلى ثلاثة ملليمترات.

قم بتركيب إبرة اختراق البياء قياس 34 وإبرة حقن قياس 36 على أذرع Z لاثنين من المتلاعبين المنفصلين X و Y و Z باستخدام حاملات الشعيرات الدموية الزجاجية. بعد ذلك ، استخدم حقنة دقيقة سعة 50 ميكرولتر متصلة بأنبوب PE10 أو PE20 لتحميل فيروس AAV9-UBI-GFP. بعد تحميل الفيروس ، قم بتوصيل نهاية الأنبوب بإبرة الحقن.

بعد ذلك ، أثناء النظر من خلال نطاق التشريح الجراحي المضبوطة على تكبير من ثمانية إلى عشرة X ، استخدم الذراع X لخفض الإبرة المخترقة في pia إلى عمق ملليمتر واحد. حافظ على زاوية الإبرة المخترقة من خمس إلى 10 درجات بالنسبة لسطح الأنسجة. بعد فتح pia ، استخدم الذراع X لإزالة إبرة اختراق pia من المساحة السفلية.

لاحظ الموقع المخترق باستخدام معلم مثل الأوعية الدموية. حرك أذرع X و Y و Z للمناور الثاني لوضع طرف إبرة الحقن المحملة بفيروس AAV9 في الموقع المخترق pia. بعد ذلك ، بعد إدخال طرف إبرة الحقن حوالي 0.5 ملم في المساحة تحت السطح ، استخدم الذراع Z لرفع pia حوالي 0.3 ملم ، ثم استخدم الذراع X لمواصلة تقدم الإبرة أفقيا إلى الفضاء الفرعي.

تقدم الإبرة حتى تدخل المساحة السفلية على عمق حوالي ملليمترين إلى ثلاثة ملليمترات ، ثم استخدم المحقنة الدقيقة سعة 50 ميكرولتر لحقن فيروس AAV9-UBI-GFP في الفضاء الفرعي. قم بإزالة إبرة الحقن من المساحة السفلية بعد اكتمال حقن AAV9-UBI-GFP. أغلق العضلات والجلد باستخدام خياطة الشعيرات العقدية والمشابك الجراحية.

اسمح للحيوان بالتعافي على وسادة تدفئة قبل وضعه في قفص نظيف. تم تسليم حقنتين ثنائيتين من AAV9-UBI-GFP في الفضاء القطني العلوي وتم إصلاح الوفيرة بعد 14 يوما من ولادة AAV9. يظهر تعبير GFP المكثف في المادة الرمادية الموجودة داخل المنطقة المنقطة والمادة البيضاء خارج المنطقة المنقطة.

يمتد هذا من أسفل الظهر إلى الأجزاء الصدرية العلوية في التي يتم حقنها بثلاثة بالإضافة إلى ثلاثة ميكرولتر من AAV9. التي يتم حقنها بحجم أقل من AAV9 لديها تعبير أقل كثافة عن GFP. تصور الصور التالية تعبير GFP القوي إلى الوراء والوسط AAV9-UBI-GFP في المراكز الحركية والحسية للدماغ.

تظهر هذه الصورة منخفضة الطاقة بوضوح وجود إيجابية GFP مكثفة في الحبل الشوكي العنقي ، والنخاع المستطيل ، والمخيخ ، والقشرة الحركية. تظهر هذه الصورة عالية الطاقة المأخوذة من قسم الدماغ السهمي وجود إزهار GFP في الخلايا العصبية في التكوين الشبكي ، ونواة النواة ، ومحاور القناة الشوكية المخيخية. توضح هذه الصورة ذات الطاقة المنخفضة المأخوذة من قسم الدماغ الإكليلي وجود إزهار GFP في الخلايا العصبية الهرمية في القشرة الحركية وفي أطراف الجهاز النخاعي في مناطق نوى المهاد الشبكي.

أخيرا ، توضح هذه الصورة عالية الطاقة تعبيرا مكثفا عن GFP في الخلايا العصبية الهرمية في القشرة الحركية. بمجرد إتقانها ، يمكن إكمال هذه التقنية في 30 إلى 40 دقيقة. سيكون استخدام هذه التقنية من قبل الباحثين في مجال علم الأعصاب أداة فعالة لدراسة دور جينات معينة في تطور الاضطرابات التنكسية في العمود الفقري.

سيساعد أيضا في استكشاف فعالية العلاج المحتملة عن طريق قمع الجينات الطافرة المعروفة بارتباطها بتنكس الخلايا العصبية الشوكية التدريجي كما هو الحال في الشكل المألوف للتصلب الجانبي الضموري.