تقييم كثافة المشبك في الدماغ القوارض هيبوكامبال شرائح

الهدف العام من بروتوكول التلوين المناعي هذا هو تقييم الكثافة المشبكية في شرائح الدماغ خارج الجسم الحي. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال علم الأعصاب وهي مفيدة عند دراسة تغيرات كثافة المشبك ، كما لوحظ في الأمراض التنكسية العصبية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها توفر تقديرا شبه كميا لكثافة المشبك ، والذي يمكن مقارنته بين الحالة التجريبية المعدة في نفس الوقت.

ابدأ بوضع دماغ الفأر على طبق بتري. بعد ذلك ، قم بإزالة المخيخ وجزء صغير من القشرة الأمامية بمشرط ، قبل أن ينقسم إلى أسفل على خط الوسط من الدماغ. اقلب نصف الكرة الأرضية على الجانب الذي تم قطعه للتو ، وألصقه على مسرح الاهتزاز.

صب ACSF المثلج في غرفة الميكروتوم ، وقم بتزويد المحلول بالأكسجين. قم بقص أقسام بسمك 200 إلى 300 ميكرون من منطقة الاهتمام الكاملة. بالنسبة للحصين ، يجب الحصول على ما يقرب من ثلاث إلى أربع شرائح لكل نصف الكرة الأرضية.

استخدم ماصة باستور بلاستيكية لنقل الشرائح إلى غرفة يتم التحكم في درجة حرارتها مغمورة في ACSF المؤكسج. يحفظ في درجة حرارة 34 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. بعد انقضاء 30 دقيقة ، انقل الشرائح إلى طبق مكون من 24 بئرا يحتوي على 4٪ بارافورمالدهيد مع 4٪ سكروز ، وثبته لمدة 20 دقيقة إلى ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة.

بعد التثبيت ، اغسل الشرائح ثلاث مرات في 1x PBS لمدة 10 دقائق في كل مرة. لبدء تلطيخ الفلورسنت المناعي ، استبدل PBS في آبار الشرائح بمخزن مؤقت مانع ونفاذة ، واحتضانه في درجة حرارة الغرفة لمدة أربع إلى ست ساعات على شاكر. قرب نهاية خطوة الحجب ، قم بتخفيف الجسم المضاد إلى vGlut1 واحد إلى 2 ، 000 في المخزن المؤقت للحجب والنفاذ.

يرجى ملاحظة أن هذا التخفيف قد يختلف اعتمادا على الشركة والكثير من الجسم المضاد المستخدم. احتضان الشرائح في محلول الجسم المضاد الأساسي طوال الليل عند أربع درجات مئوية. استخدم منصة اهتزاز بحركة قوية.

يعد التوزيع المتساوي للأجسام المضادة الأولية والثانوية أمرا مهما للتلوين الأمثل. في تجربتنا ، يتيح الاهتزاز القوي أفضل اختراق للأجسام المضادة. بعد الحضانة في الجسم المضاد الأولي ، اغسل الشرائح ثلاث مرات في PBS لمدة 10 دقائق في كل مرة ، كما كان من قبل.

خلال الغسيل الأخير ، قم بتخفيف الأجسام المضادة الثانوية المناسبة من واحد إلى 500 في المخزن المؤقت للحظر. ثم احتضن الشرائح في هذا المحلول لمدة ساعتين إلى ثلاث ساعات في درجة حرارة الغرفة. تأكد من حماية الشرائح من الضوء ، لأن الأجسام المضادة الثانوية حساسة للضوء.

بعد غسل الشرائح ، كما كان من قبل ، استخدم فرشاة لإزالة الشرائح بعناية من الطبق المكون من 24 بئرا ، ووضعها بالتساوي على شرائح زجاجية مسبقة الوصف. أضف قطرة من وسط التثبيت فوق كل شريحة. وبعد ذلك ، ضع غطاء زجاجيا برفق فوق الشرائح ، مع الحرص على تجنب تكوين فقاعات الهواء.

احميها من الضوء ، واترك الشرائح تجف لمدة لا تقل عن ثلاثة إلى أربعة أيام في درجة حرارة الغرفة. قم بتخزين الشرائح عند أربع درجات مئوية على المدى القصير. ولكن للتخزين طويل الأجل ، احتفظ بها عند 20 درجة مئوية تحت الصفر.

ابدأ باستخدام هدف 10x أو 20x لتحديد منطقة الحصين المراد تصويرها ، في هذه الحالة ، نقاط الاشتباك العصبي بين الخلايا العصبية الهرمية CA1 والمحاور الجانبية لشافر. قم بالتغيير إلى هدف الغمر بالزيت 40x أو 63x ، وتأكد من أن تشريح الشريحة سليم من خلال تحديد الخلايا العصبية المستمرة والبنية المنظمة. استخدم علامة عصبية ، مثل MAP2 ، كمرجع.

اضبط الإعدادات لكل قناة للحصول على الإشارة والتباين الأمثل بدقة 1 ، 024 × 1 ، 024 بكسل. اضبط شدة كل ليزر لتجنب تشبع أي بكسل. قم بتقييم العمق حيث يكون التلوين متساويا ، ثم اضبط البرنامج للحصول على مجموعات صور من ثماني طائرات متساوية البعد على الأقل 250 نانومتر.

بعد ذلك ، التقط ثلاث مجموعات صور تمثيلية متجاورة من نفس منطقة الاهتمام لكل شريحة. كرر الاستحواذ في ثلاث شرائح على الأقل لكل حالة ومن ستة إلى ثمانية لكل مجموعة علاج. يمكن تحديد نقاط الاشتباك العصبي المثيرة عن طريق التحديد المشترك بين vGlut1 و PSD95 ، كما هو موضح في الأسهم البيضاء في صورة التكبير الأعلى.

يؤدي حصار إشارات Wnt في الحصين البالغ عن طريق إحداث مضاد Wnt Dkk1 إلى فقدان المشبك الاستثاري ، وتحديدا في الطبقة CA1 radiatum. تم قياس النسبة المئوية للمشابك المثيرة بين الفئران الضابطة والفئران iDkk1 ووجد أنها أقل بكثير في المعدلة وراثيا iDkk1. يمكن تحديد المشابك المثبطة من خلال التحديد المشترك بين vGat و Gephyrin.

تم تحديد النسبة المئوية للمشابك المثبطة بين الفئران الضابطة والفئران iDkk1 ، ولم يتم الكشف عن فرق كبير أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر توخي الحذر قدر الإمكان مع الشرائح. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تقييم الكثافة المشبكية في شرائح الدماغ خارج الجسم الحي.