عالية الدقة الفلورسنت في الموقع التهجين في المورفولوجية الأجنة والأنسجة باستخدام التضخيم الإشارات تيراميدي

الهدف العام من هذا الإجراء هو اكتشاف نسخ الحمض النووي الريبي الموجودة داخل الخلايا والأنسجة. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في الخلية ومجالات علم الأحياء التنموية مثل مكان وجود الحمض النووي الريبي داخل الخلية أو الأنسجة أو الجنين. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تكتشف التوزيعات المكانية للحمض النووي الريبي بمستويات عالية من الدقة والحساسية وبتكلفة منخفضة مقارنة بالطرق الأخرى.

قمنا في البداية بتطوير هذا البروتوكول لدراسة التوزيعات تحت الخلوية لأكبر عدد ممكن من ذبابة الفاكهة الحمض النووي الريبي. كان هذا من أجل تحديد مدى وتنوع التوزيعات تحت الخلوية. بدأنا المشروع بالعمل مع الجنين ، لكننا قمنا لاحقا بتكييف البروتوكول وتحسينه حتى نتمكن من العمل بإنتاجية عالية مع الأنسجة التي تم تشريحها من اليرقات والذباب.

أصعب جانب في الإجراء هو عدد الخطوات واحتمالية الخطأ اللاحقة بالإضافة إلى الحاجة إلى ضمان عدم وجود الحمض النووي الريبي أثناء إنتاج المسبار. لتسهيل الإنتاجية والفعالية من حيث التكلفة ، تستخدم الإجراءات الموضحة في هذا الفيديو ألواح ميكروتيتر 96 بئرا لجميع الخطوات. من السهل أيضا تكييف هذه الطريقة مع أعضاء العينة الأصغر عن طريق تقطيع الألواح إلى ثمانية أو 12 شرائح بئر.

ابدأ بتخفيف 10 ميكرولترات من المزرعة البكتيرية بين عشية وضحاها في 90 ميكرولترا من الماء المقطر المزدوج المعقم في كل بئر من لوحة PCR جديدة مكونة من 96 بئرا. قم بتغيير طبيعة الحمض النووي عند 95 درجة مئوية في جهاز تدوير حراري لمدة خمس دقائق. ضع الطبق على الفور على الجليد لمدة خمس دقائق على الأقل.

قم بإعداد تفاعلات تفاعل البوليميراز المتسلسل في لوحة PCR جديدة سعة 96 بئرا. استخدم البادئات العالمية المناسبة وكمية 48 ميكرولترا من مزيج PCR الرئيسي في كل بئر. أضف ميكرولترين من كل قالب بلازميد DNA مشوه لكل بئر.

قم بإجراء التضخيم في جهاز PCR سعة 96 بئرا. عند اكتمال التضخيم ، قم بترسيب منتج تفاعل البوليميراز المتسلسل بمزيج أسيتات الصوديوم الإيثانول. قم بتخزين العينات لمدة 30 دقيقة عند 80 درجة مئوية تحت الصفر.

جهاز الطرد المركزي للوحة 96 بئرا عند 2 ، 250 مرة جم عند أربع درجات مئوية لمدة 45 إلى 60 دقيقة. باستخدام ماصة مشعب فراغ ثماني القنوات لها هيكل يمنع الأطراف من الذهاب إلى قاع الآبار في امتصاص الكريات ، قم بإزالة المادة الطافية بعناية. يغسل مرة واحدة ب 160 ميكرولتر من الإيثانول البارد 70٪.

جهاز طرد مركزي عند 2 ، 250 مرة جم عند أربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق. اقلب اللوحة المكونة من 96 بئر برفق على منشفة ورقية لإزالة آخر قطرات السائل في كل بئر وجفف كريات الحمض النووي بالهواء في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة. أعد تعليق الحمض النووي المترسب في 25 ميكرولتر من الماء الخالي من RNase.

تحقق من حجم وعائد منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل عن طريق الرحلان الكهربائي لجل الاغاروز. قم بإعداد تفاعلات النسخ في المختبر عن طريق إضافة المكونات المناسبة لكل بئر في لوحة PCR جديدة مكونة من 96 بئرا. أضف 7.5 ميكرولتر من قالب الحمض النووي إلى كل بئر مقابل.

قم بتغطية اللوحة بشريط مانع للتسرب. احتضن اللوحة عند 37 درجة مئوية لمدة 3-1 / 2 إلى أربع ساعات. بعد ذلك ، أضف إلى كل بئر مزيجا رئيسيا يتكون من الماء المقطر المزدوج المعالج ب DEPC ، و 100٪ إيثانول ، وثلاثة أسيتات الصوديوم المولارية.

يحفظ في درجة حرارة 80 درجة مئوية تحت الصفر لمدة 30 دقيقة. الطرد المركزي للوحة وغسل الآبار كما هو موضح سابقا. أعد تعليق المسبار المترسب في 25 ميكرولتر من الماء المقطر المزدوج المعالج ب DEPC.

تم تشغيل مجسات الحمض النووي الريبي المضادة للمعنى المركبة حديثا على هلام الاغاروز بنسبة 1٪ للتحقق من السلامة والعائد. بناء على شدة النطاق ، يمكن وصف العائد بأنه عائد منخفض أو عائد نموذجي أو عائد مرتفع. بعد استخدام خمسة ميكرولتر من كل مسبار للرحلان الكهربائي لهلام الاغاروز ، امزج 20 ميكرولترا المتبقية مع 100 ميكرولتر من محلول التهجين وقم بتخزينها عند 80 درجة مئوية تحت الصفر لحين الحاجة.

لبدء هذا الإجراء ، ضع 20 إلى 30 يرقة في طبق بتري يحتوي على PBS بارد في محلول واحد وقم بتبريده على الجليد لمدة دقيقتين لتقليل حركة اليرقات. تشريح اليرقات تحت نطاق التشريح. استخدم زوجا من الملقط الحاد لفتح الجزء الأمامي بعناية والضغط على الأنسجة من الخلف إلى الأمامي.

بعد 15 دقيقة كحد أقصى ، انقل الأنسجة المقطوعة إلى أنبوب سعة 1.5 مل للتثبيت وضعها على الجليد. قم بإزالة PBS وأضف 800 ميكرولتر من محلول واحد. احتضن على الخلاط العلوي لمدة 30 دقيقة جنبا إلى جنب مع الخلاط الآخر الذي تم جمعه مسبقا في مناديل التثبيت.

اشطف المناديل مرة واحدة ب 800 ميكرولتر من PBTT واحتفظ بالأنبوب على الجليد أثناء جمع الأنسجة الإضافية وإصلاحها. قم بتجميع جميع الأنسجة المقطعة في أنبوب بلاستيكي واحد سعة 15 مليلتر يحتوي على شبكة في غطاء الأنبوب. استنشق السائل الزائد من خلال الشبكة الموجودة في الغطاء.

يغسل ب 10 مل من PBTT ويشطف ب 10 مل من PBS. لإخماد نشاط بيروكسيداز فجل الحصان الداخلي ، أضف خمسة ملليلتر من بيروكسيد الهيدروجين بنسبة 0.3٪ في PBS واحتضانه في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة. يغسل مرتين مع 10 مل من PBTT.

قم باختراق الأنسجة عن طريق إضافة 10 مل من الأسيتون المبرد مسبقا بنسبة 80٪ واحتضانها عند 20 درجة مئوية تحت الصفر لمدة 10 دقائق. يغسل مرتين ب 10 مل من PBTT لترطيب الأنسجة. بعد غسل المناديل كما هو موضح في بروتوكول النص ، قم بتخزينها في محلول تهجين عند درجة حرارة 20 درجة مئوية تحت الصفر.

إذا لم يتم استخدامها بحلول اليوم التالي ، فيجب استبدال مجموعة المرشح بغطاء عادي. Aliquot حوالي 20 ميكرولترا لكل بئر من الأنسجة في لوحة PCR 96 بئر على الجليد. باستخدام ماصة مشعبة ثماني قنوات ، قم بإزالة محلول التهجين من الأنسجة.

أضف 100 ميكرولتر من محلول التهجين المشوه حديثا إلى كل بئر وقم بتغطيته بشريط مانع للتسرب. قم بتهجين الأنسجة مسبقا عند 56 درجة مئوية باستخدام وحدة تسخين حمام جاف تحتوي على خرز معدني لمدة لا تقل عن 2-1 / 2 إلى ثلاث ساعات. قم بتفكيك طبيعة 100 ميكرولتر من المسبار المحضر في لوحة PCR سعة 96 بئرا عند 80 درجة مئوية لمدة خمس دقائق.

تبرد على الفور على الثلج لمدة خمس دقائق. قم بإزالة محلول ما قبل التهجين من الأنسجة وأضف مجسات خاصة بالجينات مشوهة إلى كل عينة. قم بتغطيتها بشريط مانعة للتسرب من الألومنيوم وقم بتهجينها عند 56 درجة مئوية تحت خرز معدني في وحدة تسخين حمام جاف لمدة 16 إلى 18 ساعة طوال الليل.

قبل البدء في إجراء الكشف عن المسبار ، قم بتسخين جميع المحاليل المطلوبة مسبقا في وحدة التسخين 56 درجة مئوية. انقل الأنسجة المهجنة بعناية إلى صفيحة ذات 96 بئرا تناسب مشعب تفريغ الألواح متعدد الآبار. تحتوي آبار هذه الألواح على قيعان غشائية تسمح بإزالة المحتويات تحت الفراغ.

قم بإزالة المجسات من اللوحة المكونة من 96 بئرا واغسل العينات بمخاليط من محلول التهجين و PBTT وفقا للخطوات الموضحة في هذا الجدول في وحدة التسخين 56 درجة مئوية. بعد الغسيل الثالث باستخدام PBTT ، قم بإزالة اللوحة المكونة من 96 بئرا من وحدة التسخين ، وقم بإزالة محلول PBTT ، وسد المناديل باستخدام PBTTB على الخلاط العلوي على مقاعد البدلاء في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة. أضف 100 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة لكل بئر واحتضن لمدة ساعتين على خلاط العينات العلوي على مقاعد البدلاء.

بعد الشطف باستخدام PBTTB كما هو موضح في بروتوكول النص ، أضف 100 ميكرولتر من محلول بيروكسيداز فجل الحصان ستربتافيدين لكل بئر واحتضانه في درجة حرارة الغرفة لمدة 1-1 / 2 ساعة. يغسل مرتين باستخدام PBTTB لمدة خمس دقائق لكل غسلة. بعد ذلك ، احتضان الأنسجة بمحلول DAPI كما هو موضح في بروتوكول النص.

ابدأ هذا الإجراء عن طريق احتضان العينات بمحلول التيراميد واحتضان العينات لمدة ساعتين على الخلاط العلوي على مقاعد البدلاء في الظلام. قم بإزالة محلول التيراميد من الأنسجة بمجرد الانتهاء من الحضانة. بعد الغسيل باستخدام PBT و PBS كما هو موضح في بروتوكول النص ، أضف 150 ميكرولترا من وسائط التثبيت المضادة للبهتان لكل بئر.

احتفظ بالعينات عند أربع درجات مئوية طوال الليل للسماح للأنسجة بالغرق في قاع البئر أو الأنبوب. في اليوم التالي ، قم بتركيب العينات على شريحة مجهرية وختمها بغطاء غطاء. أخيرا ، قم بتصوير العينات باستخدام المجهر الفلوري.

تظهر أمثلة على النتائج التي تم الحصول عليها باستخدام هذا الإجراء لأجنة ذبابة الفاكهة المبكرة وأجنة ذبابة الفاكهة المتأخرة مع إشارات في مصيحة السلى والعضلات والجهاز العصبي المركزي. يتم عرض اسم الجين الذي تم تهجين المسبار إليه في كل لوحة. فيما يلي أمثلة من أنسجة اليرقات في الطور الثالث ، والأنابيب المالبيجي ، والأمعاء الوسطى ، والغدد اللعابية ، والعضلات.

أخيرا ، يتم عرض صور تمثيلية من المبيض البالغ والخصيتين البالغين. بمجرد إتقانها وإذا تم إجراؤها بكفاءة ، يمكن القيام بهذه التقنية في أقل من يومين. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر العمل على مقعد خال من RNase مع أطراف وأنابيب وألواح ومحاليل خالية من RNase واستخدام القفازات.

إذا كنت تعمل مع عدد كبير من العينات أو المجسات ، فلا تتسرع في الإجراء. ومن الجيد أيضا ابتكار الحيل حتى لا تنسى مكانك. عند اتباع هذا الإجراء ، يمكنك أيضا دمجه مع طرق أخرى مثل اكتشاف مجسات متعددة أو مجسات بالبروتينات أو العلامات الخلوية.

باستخدام هذه ، يمكنك الإجابة على أسئلة إضافية مثل أنماط التعبير النسبي ، وهويات حجرة الخلايا والخلوية ، والتأثيرات في الخلفيات الجينية أو الأمراض المختلفة. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إجراء معظم أنواع التهجين في الموقع في أي نوع من الأنسجة أو الأجنة. لا تنس أن العمل مع الكواشف مثل الفورمالديهايد وبيروكسيد الهيدروجين والفورماميد يمكن أن يكون خطيرا للغاية ويجب دائما اتخاذ الاحتياطات مثل المناولة والتخلص المناسبين أثناء تنفيذ الإجراء.