تلفيق من الآبار المخصصة [اغروس] لبذر الخلية والأنسجة خاتم التجميع الذاتي باستخدام قوالب طباعة 3D

الهدف العام من هذا الإجراء هو إنشاء قوالب بذر خلايا مخصصة تستخدم لصنع حلقات أنسجة ذاتية التجميع بأبعاد مختلفة. تسمح لنا هذه الطريقة بإنشاء حلقات نسيجية ثلاثية الأبعاد من الخلايا البشرية يمكن استخدامها لتقييم بنية الأنسجة وقوتها ووظيفتها. الميزة الأساسية لهذه التقنية هي أنها طريقة بسيطة لتصنيع قوالب للأنسجة المجمعة ذاتيا بأبعاد مخصصة.

لبدء الإجراء ، استخدم برنامج التصميم بمساعدة الكمبيوتر لإنشاء رسم لقالب بالأبعاد المطلوبة. أرسل ملف CAD إلى طابعة ثلاثية الأبعاد عالية الدقة. اطبع القالب في بلاستيك بلمسة نهائية لامعة ثابتة عند 50 درجة مئوية.

اغسل القالب المطبوع جيدا بفرشاة ومنظف وماء. اشطف القالب بالماء المقطر واتركه يجف في الهواء في الرف. من المهم اختيار بلاستيك مطبوع ثلاثي الأبعاد مستقر في درجة حرارة معالجة PDMS.

قد تؤثر البقايا التي تنتقل إلى PDMS أثناء التسخين على تكوين الحلقة. بعد ذلك ، قم بقياس 25 جراما من قاعدة PDMS في قارب وزن يمكن التخلص منه. أضف عامل المعالجة بنسبة 1:10 بالوزن وحركه بقوة حتى تمتزج القاعدة وعامل المعالجة جيدا.

بعد ذلك ، قم بتثبيت شريط المختبر حول جوانب القالب لتشكيل جدار يبلغ ارتفاعه حوالي سنتيمتر واحد حول الوجه مع الآبار المطبوعة. تأكد من عدم وجود فجوات في جدار الشريط. صب خليط PDMS في القالب المطبوع ثلاثي الأبعاد.

قم بإزالة الغازات من PDMS في غرفة مفرغة لمدة 30 إلى 60 دقيقة أو حتى تختفي فقاعات. قم بمعالجة PDMS عند 50 درجة مئوية لمدة ساعتين إلى أربع ساعات أو حتى يصبح PDMS صلبا بدرجة كافية لإزالته من القالب. ثم قم بإزالة الشريط ، وافصل PDMS السلبي بعناية عن القالب.

احتضان PDMS سالب في فرن على حرارة 60 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة للتأكد من شفائه تماما. ثم اغسل السلبية جيدا بالمنظفات والماء. اشطف القالب بالماء المقطر واتركه يجف في الهواء.

قبل تصنيع قالب الاغاروز ، قم بتعقيم PDMS السلبي ، وزوج من الملقط الحاد ، وأي أدوات أخرى مرغوبة. لبدء التصنيع ، قم بإعداد وتعقيم ما لا يقل عن 50 مل من اثنين بالمائة من agarose في DMEM. تحضير آبار الاغاروز قبل يوم واحد من البذر الحلقي.

ماصة أربعة ملليلتر من الاغاروز المنصهر في PDMS السلبي المعقم ، مع الحرص على عدم ملء القالب. ثم ، قم بسحب الماصة المنصهرة في التجاويف لأعمدة بئر الاغاروز. استخدم طرف الماصة لإزالة جميع فقاعات الهواء.

يجب أن يكون سطح الاغاروز النهائي مسطحا. دع الاغاروز يبرد لمدة 10 دقائق. بعد ذلك ، استخدم ملقطا غير حاد لفصل قالب الاغاروز المبرد بعناية عن PDMS السلبي.

ضع القالب ووجهه لأعلى في بئر واحد من ستة آبار. أضف وسط الثقافة الكامل المناسب إلى الطبق جيدا حتى يتم غمر آبار الاغاروز بالكامل. قم بموازنة آبار الاغاروز عند 37 درجة مئوية طوال الليل قبل الاستخدام.

أولا ، في طبق استزراع 15 سم ، قم بزراعة خلايا العضلات الملساء الأبهري للفئران عند 37 درجة مئوية في جو من ثاني أكسيد الكربون بنسبة 5 في المائة حتى يتم تحقيق التقاء بنسبة 70 بالمائة. بمجرد تحضير قالب الاغاروز المطلوب وتوازنه طوال الليل ، اشطف طبق المزرعة مرتين بخمسة ملليلتر من المحلول الملحي المخزن بالفوسفات. بعد إزالة PBS ، أضف ثلاثة ملليلتر من 0.25 في المائة من تريبزن إلى الطبق.

احتضن عند 37 درجة مئوية لمدة دقيقتين إلى ثلاث دقائق أو حتى ترفع الخلايا من الطبق. قم بتحييد التريبزين بثلاثة ملليلتر من وسط الثقافة الكامل. انقل الخلايا إلى أنبوب مخروطي الشكل ، وقم بماصة الخلايا برفق حتى يتم تعليقها تماما.

خفف أليكوات من تعليق الخلية بحجم متساو من صبغة التريبان الزرقاء ، واحسب الخلايا باستخدام مقياس الدم. ثم ، قم بالطرد المركزي للتعليق عند 200 مرة G لمدة خمس دقائق. قم بإزالة المادة الطافية وإعادة تعليق الخلايا في وسط مزرعة كامل لتحقيق تركيز 10 ملايين خلية لكل مليلتر.

تتمثل أهم الخطوات لضمان تكوين الحلقة المتسقة في تحسين عدد الخلية ووسط الثقافة لخط الخلية الذي تستخدمه. بعد ذلك ، احصل على آبار الاغاروز المتوازنة. استنشق بعناية جميع الوسائط من كل من الخارج من الاغاروز ، وداخل آبار الاغاروز ، مع الحرص على عدم ثقب قيعان الآبار.

ماصة 50 ميكرولتر من تعليق الخلية في كل بئر. أضف ملليلترين من الوسط الطازج حول الجزء الخارجي من آبار الاغاروز دون ترك الوسط ينسكب في الآبار. احتضان اللوحة طوال الليل عند 37 درجة مئوية في غلاف جوي من ثاني أكسيد الكربون بنسبة خمسة بالمائة للسماح للخلايا بالتجميع.

ثم استنشق الوسط من خارج الاغاروز. أضف 4.5 مل من الوسط الطازج إلى الطبق جيدا حتى تمتلئ آبار الاغاروز ويتم غمر قالب الاغاروز بالكامل. استمر في احتضان اللوحة حتى يتم تطوير حلقات الأنسجة بشكل كاف ، واستبدال الوسط كل يوم.

ثم حرك كل حلقة مناديل برفق من عمودها باستخدام ملقط. على الفور ، قم بإصلاح الحلقات لعلم الأنسجة ، أو استخدم الحلقات للتقييمات الوظيفية أو الميكانيكية. سمحت الطباعة ثلاثية الأبعاد بتصميم قالب أكثر مرونة.

كانت أقطار المنشورات متنوعة بسهولة ، كما هو موضح حلقات خلايا العضلات الملساء للفئران ملفقة حول أعمدة بأقطار اثنين وأربعة واثني عشر ملم. كما تم تحضير حلقات الأنسجة من الخلايا الجذعية الوسيطة البشرية الأولية ، والخلايا الجذعية الوسيطة البشرية ، و SMCs المشتقة من الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات. تم استخدام الحلقات كنماذج أنسجة في المختبر لتقييم وظيفة الأنسجة والقوة الميكانيكية.

على الرغم من أن هذه الطريقة تم تصميمها في الأصل لتصنيع ونمذجة أنسجة الأوعية الدموية ، إلا أنه يمكن استخدامها أيضا لتصنيع أجزاء من أنواع الأنسجة الأخرى أيضا ، مثل الغضاريف والعضلات الهيكلية وأنسجة القلب. توفر هذه الطريقة طريقة بسيطة للباحثين لإنشاء قوالب مخصصة لتصنيع حلقات مناديل ثلاثية الأبعاد بأبعاد مختلفة. يمكن استخدام هذه الحلقات لتقييم الهيكل والخصائص الميكانيكية ووظيفة الأنسجة الهندسية المصنوعة من أنواع مختلفة من الخلايا.