وسم المناعية-فلوري Microtubules والبروتينات سينتروسومال في 3D في المختبر أورجانويدس الأمعاء والأنسجة المعوية السابقين فيفو

الهدف العام من هذا الإجراء هو عزل 3D في المصفوفة القاعدية في المختبر ، والمواد العضوية المعوية المدمجة ، وبالتالي إصلاح وتصنيف مناعي للأنابيب الدقيقة والعضيات proteins. 3D الوسطى في المختبر هي نماذج مثالية لدراسة الأسئلة البيولوجية الرئيسية في بيولوجيا الخلية والتنموية. لكن توطين البروتينات والهياكل الذاتية في النماذج ثلاثية الأبعاد أكثر تعقيدا مما هو عليه في الثقافات ثنائية الأبعاد.

الأهم من ذلك ، يحتاج المثبت إلى الحفاظ على البنية ثلاثية الأبعاد الدقيقة مع الحفاظ أيضا على مضاد الجسم المضاد. تشمل الطرق المعروضة العزل والتثبيت ووضع العلامات المناعية على 3D في المختبر للعضيات المعوية. ولكن يمكن أيضا استخدام بروتوكولات التثبيت ووضع العلامات المناعية في الأنسجة المعزولة خارج الجسم الحي.

الميزة الرئيسية لبروتوكول تثبيت الميثانول الفورمالديهايد المقدم هي أنه يحافظ على الهياكل ثلاثية الأبعاد مع الحفاظ أيضا على المستضد. إنه يتيح الاختراق الجيد وإزالة الأجسام المضادة tevel المثبتة بعد التثبيت من أجل وضع العلامات الفعالة للأنابيب الدقيقة وخيوط الأكتين والبروتينات المرتبطة والعديد من البروتينات المركزية بما في ذلك ninein. ستظهر الإجراء الدكتورة ديبورا جولدسبينك ، باحثة ما بعد الدكتوراه الرسمية في مختبري ، والطبيبة زوي ماثيوز ، المؤلفة المشاركة.

بعد عزل الخبايا المعوية والزغابات ، يمكن إصلاح الهياكل الظهارية المعزولة للتلوين المناعي. يمكن وضع الخبايا المعزولة بالتناوب في قباب مصفوفة ستشكل بعد ذلك عضويات. بعد ما يقرب من خمسة إلى سبعة أيام من الحضانة ، ستتشكل العضيات.

استخدم 500 ميكرولتر من RT-PBS لغسل الآبار التي تحتوي على قباب مصفوفة الطابق السفلي بالمواد العضوية. ثم أضف 250 ميكرولترا من محلول استعادة الخلايا الباردة إلى كل بئر. بعد ذلك ، باستخدام ماصة دقيقة P1000 ، اكشط قباب مصفوفة الطابق السفلي وقم بسحب الماصة بعناية لأعلى ولأسفل في جميع أنحاء البئر لتفتيت وإزالة مصفوفة الطابق السفلي من البلاستيك.

تأكد من أن محلول الاسترداد بارد للمساعدة في تكسير المصفوفة. عند الكشط ، استخدم فقط ماصة دقيقة P1000 حتى لا تتفتيت العضيات وتظل سليمة. اجمع المادة الطافية في أنابيب طرد مركزي دقيقة منخفضة الارتباط سعة 1.5 ملليلتر.

بعد ذلك ، اقلب الأنبوب عدة مرات وتحقق تحت المجهر في بعض الأحيان 50 تكبيرا من أن العضيات قد تم عزلها ، وهي تتحرك بحرية وليست في كتل. حبيبات العضيات عن طريق الطرد المركزي عند 1 ، 000 غرام ودرجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. ثم قم بإزالة كاشف الاسترداد وانتقل على الفور إلى التثبيت.

لإصلاح العضيات المعزولة مسبقا بالفورمالديهايد والميثانول ، أعد تعليق العضيات في محلول مثبت الميثانول فورمالديهايد سالب 20 درجة مئوية. احتضان العضيات عند درجة حرارة 20 درجة مئوية تحت الصفر في الفريزر لمدة 15 دقيقة ، مع قلب الأنبوب كل خمس دقائق. ثم ، قم بتكسير العضيات عن طريق الطرد المركزي عند 1 ، 000 جم لمدة خمس دقائق.

قم بإزالة المثبت ثم أضف محلول الغسيل المكون من PBS مع مصل أنواع الأجسام المضادة الثانوية بنسبة 1٪ أو PBS مع منظف 0.1٪ ومصل 1٪. بعد تكوير العينة كما كان من قبل ، قم بإزالة محلول الغسيل وإعادة تعليق العينة في محلول غسيل طازج. استخدم دوار أنبوبي لغسل الخلايا لمدة ساعة واحدة ، مع تكوير العضيات عن طريق الطرد المركزي كل 15 دقيقة واستبدال محلول الغسيل.

لمنع عينات العضوية المعوية ، أضف مصل أنواع الأجسام المضادة الثانوية بنسبة 10٪ إلى PBS. حبيبات العضيات على حرارة 1,000 غرام لمدة خمس دقائق وإزالة المادة الطافية. أضف محلول حجب مليلتر واحد لكل عينة ليتم تحضينها في الأجسام المضادة المختلفة.

ثم قم باحتضان العينات ومحلول الحجب على أنبوب دوار في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة. بعد ذلك ، قم بتخفيف الأجسام المضادة الأولية في PBS التي تحتوي على 10٪ مصل و 0.1٪ منظف. بعد ذلك ، بعد تدوير العينات وإزالة محلول الانسداد ، استخدم محلول الجسم المضاد الأساسي لإعادة تعليق الحبيبات العضوية.

قم بتدوير الأنابيب عند 20 دورة في الدقيقة وأربع درجات مئوية طوال الليل للحفاظ على العضيات في حالة تعليق. في اليوم التالي ، أعد العينات إلى درجة حرارة الغرفة على دوار الأنبوب لمدة ساعة واحدة. بعد تدوير العينة ، قم بإزالة محلول الجسم المضاد الأساسي ، وأضف ملليلترا واحدا من محلول الغسيل إلى كل أنبوب وأعد تعليق الكريات العضوية.

ثم قم بإزالة المحلول على الفور عن طريق الطرد المركزي. أضف ملليلترا واحدا من محلول الغسيل الطازج واخلط الخلايا على أنبوب دوار بسرعة 20 دورة في الدقيقة لمدة ساعتين. بعد ذلك ، قم بتخفيف الأجسام المضادة الثانوية في PBS باستخدام مصل 1٪ و 0.1٪ منظف.

ثم ، بعد تكوير الأنسجة ، أعد تعليق الكريات في 200 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة الثانوية. احتضان الأنابيب على دوار أنبوب في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة. بعد الغزل وإزالة المادة الطافية ، قم بتعليق الحبيبات في محلول الغسيل وقم على الفور بالطرد المركزي للعينات لحبيبات العضيات.

ثم, إزالة المادة الطافية وإعادة تعليق الحبيبات في ملليلتر واحد من محلول الغسيل الطازج. امزج العينات على أنبوب دوار في درجة حرارة الغرفة لمدة 1.5 إلى ساعتين ، مع تغيير محلول الغسيل كل 20 إلى 30 دقيقة كما هو موضح سابقا. لتركيب العضيات ، بعد الدوران وإزالة كل محلول الغسيل ، أضف قطرتين من وسط التثبيت الصلب مع الكاشف المضاد للبهتان إلى الحبيبات.

قم بقص نهاية الماصة الدقيقة P200 وأعد تعليق الحبيبات بعناية في وسط التثبيت. عند إعادة تعليق العضيات الثابتة والملطخة في وسط التركيب ، احرص على عدم إدخال أي فقاعات. في حالة وجود فقاعات ، اسمح لها بالطفو على السطح ثم تجنب نقلها إلى الشريحة.

استخدم الماصة الدقيقة لتوزيع العضيات ذات الوسط التثبيت في خط على طول مركز شريحة المجهر. بعد ذلك ، ضع زجاج غطاء بعناية فوقه وتجنب توليد الفقاعات. ضع الشريحة الزجاجية في دفتر شرائح واحفظها في الثلاجة طوال الليل حتى يتم ضبط وسيط التثبيت قبل التحليل على مجهر متحد البؤر.

تظهر هنا صور من الجزء الثاني من أنسجة الأمعاء الدقيقة المعزولة التي تحتوي على كل من الزغابات والخبايا وعينة من الجزء الثالث الذي يحتوي بشكل أساسي على الخبايا. كما هو موضح في هذه الصور ، تم تحقيق الحفاظ الجيد على الأنابيب الدقيقة والأكتين ووضع العلامات عليها في كل من الزغابات والخبايا من خلال بروتوكول تثبيت الميثانول الفورمالديهايد ووضع العلامات المناعية الموصوف في هذا الفيديو. تم إنشاء عضيات الأمعاء الدقيقة ونمت في مصفوفة الطابق السفلي لمدة ثلاثة أسابيع أو أكثر ، ثم عزلها كما هو موضح في هذا الفيديو.

الخلايا المتمايزة داخل مجالات الزغابات العضوية على أنابيب دقيقة قشرية مستقرة تم تصنيفها جيدا في معظم الحالات. يمكن أيضا رؤية EB1 على طول شبكة الأنابيب الدقيقة. يظهر هنا عضوية في مرحلة الكيس وفي مرحلة مبكرة من تطور الخبايا.

تم تثبيت كلتا العينتين في ميثانول الفورمالديهايد وتم وضع علامة مناعية للأنابيب الدقيقة والنينين ، مما يدل على الحفاظ الجيد على الأنابيب الدقيقة ووضع العلامات عليها في مراكز تنظيم الأنابيب الدقيقة غير المركزية القمي. بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء هذه التقنية بعينات متعددة وعلى مدار يومين. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم كشط الآبار بعناية عند جمع العضيات لتجنب تعطيل هيكلها ثلاثي الأبعاد.

كن حذرا أيضا عند إضافة أو إزالة المحاليل لمنع فقدان العضيات طوال عملية التلوين. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إصلاح العضيات المعزولة والهياكل الظهارية الأخرى مثل الخبايا المعوية وتصنيفها المناعي وتركيبها. لا تنس أن الكواشف المثبتة العاملة في هذا الإجراء يمكن أن تكون خطيرة للغاية.

يجب إجراء تقييمات للمخاطر لهذا الإجراء واتخاذ تدابير الاحتواء المناسبة ومعدات الوقاية الشخصية دائما أثناء تنفيذ هذا الإجراء.