التحقيق "تضر الآثار من منخفضة الضغط البلازما التعقيم" على البقاء لجراثيم Bacillus نجحت "باستخدام خلية يعيش مجهرية"

هذا البروتوكول يوضح الخطوات المتتالية الهامة اللازمة لتقييم مدى أهمية رصد المعلمة الحيوية وعمليات إصلاح الحمض النووي في أحياء أبواغ عصيات نجحت بعد العلاج مع انخفاض ضغط البلازما بواسطة تتبع إصلاح الحمض النووي المسمى fluorescence البروتينات عن طريق الفحص المجهري [كنفوكل] حل الوقت ومسح المجهر الإلكتروني.

الهدف العام لهذه المجموعة من الطرق المتتالية هو تصور ومراقبة معلمات الحيوية في إصلاح الحمض النووي في إحياء جراثيم العصيات الرقيقة بعد علاج البلازما ذات الضغط المنخفض باستخدام الفحص المجهري الفلوري متحد البؤر الذي تم حله بمرور الوقت والفحص المجهري الإلكتروني الماسح. يمكن أن تساعد طريقتنا في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال التعطيل والتعقيم الميكروبي. يساعدنا على تحليل التأثير الضار للعلاج بالبلازما منخفض الضغط على المؤشرات البيولوجية مثل جراثيم العصيات الرقيقة.

الميزة الرئيسية لتقنيتنا هي أننا نجمع بين عدة طرق لتحديد الرؤية ، ومسح المجهر الإلكتروني ومراقبة إصلاح الحمض النووي باستخدام الفحص المجهري الفلوري للنتيجة الزمنية من أجل التحقق من التأثير الضار للعلاج بالبلازما ذات الضغط المنخفض. لإجراء إنتاج الأبواغ ، قم بنقل مزرعة خمسة ملليلتر بين عشية وضحاها من سلالة B.subtilis المعنية المكملة بالمضادات الحيوية المناسبة إلى 200 مل من وسط بواغ ماكينة الحلاقة السائلة مزدوجة القوة وزراعتها بتهوية قوية عند 37 درجة مئوية لمدة 72 ساعة على الأقل أو أكثر حتى يتم تكاثر أكثر من 95٪ من المزرعة. حصاد الجراثيم في أنابيب سعة 15 مليلتر عن طريق الطرد المركزي عند 3000 جم لمدة 15 دقيقة وتنقية العينات باستخدام H2O المقطر المعقم في خطوات الغسيل المتكررة.

تحقق من النقاء وحالة الإنبات عن طريق تنظير تباين الوجه وتأكد من أن معلقات الأبواغ تتكون من أكثر من 99٪ من الجراثيم الساطعة الطورية وخالية من الخلايا الخضرية والجراثيم النابتة وحطام الخلايا ، وإلا فقد يتم إزعاج المزيد من تجارب الفحص المجهري. حدد عيار البوغ عن طريق طلاء 50 ميكرولترا من التخفيفات التسلسلية بمقدار عشرة أضعاف على LB agar لحساب CFUs واحتضان الألواح عند 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها. بعد تحديد CFU ، اضبط العينة على 10 إلى 9 جراثيم لكل مليلتر عن طريق تركيز أو استخدام ماء معقم لتخفيف العينات.

ضع حامل عينة على شكل شرائح مجهرية معقمة أو زلات غطاء مستديرة مقاس 25 ملم داخل وحدة رش الهباء الجوي التي تعمل بالكهرباء بمحاذاة الفوهة. انقل ثقافة الأبواغ إلى مدخل سائل الفوهة وابدأ الرش في 0.15 ثانية بضغط 1.3 بار. يشكل تعليق البوغ المرشوش طبقة رقيقة على الشريحة المجهرية التي تجف بسرعة في غضون ثوان لتشكيل طبقة أحادية بوغية موزعة بشكل موحد.

قم بتخزين ناقلات العينات المعالجة في وعاء معقم في درجة حرارة الغرفة. لتنظيف وتسخين جميع الأسطح في نظام البلازما ، ابدأ النظام بخمسة باسكال مع بلازما الأرجون عند 500 واط لمدة خمس دقائق. تقلل المعالجة المسبقة من التصاق الجزيئات من الهواء المحيط مثل النيتروجين والأكسجين والماء أثناء تنفيس الغرفة.

بعد تنفيس الغرفة ، ضع العينات بعناية على رفوف زجاجية في وسط وعاء المفاعل. أغلق الغرفة وأخلئها. بعد ذلك ، استخدم غاز العملية المطلوب لملء الغرفة وتنظيم الضغط في النظام إلى خمسة باسكال.

ثم ابدأ عملية البلازما. بعد وقت العملية المحدد ، قم بإيقاف تشغيل مصدر الطاقة والغاز وتنفيس النظام بعناية لمنع نفخ العينات من حامل العينة. بعد التهوية ، قم بإزالة العينات وتخزينها في وعاء معقم.

بالنسبة للضوابط غير المعالجة بالبلازما، قم بتعريض العينات للتفريغ فقط في وجود غاز المعالجة المكافئ لأطول وقت للبلازما المطبقة. قم بإعداد محلول من أسيتات البولي فينيل المعقمة بنسبة 10٪ أو PVA واستخدم 500 ميكرولتر منه لتغطية ناقلات العينة بعناية. بعد تركها تجف في الهواء لمدة أربع ساعات ، استخدم ملقطا معقما لتجريد طبقة PVA المجففة التي تحتوي الآن على عينة البوغ ونقلها إلى أنبوب تفاعل سعة 2 ملليلتر.

أضف ملليلترا واحدا من الماء المعقم إلى الأنبوب وقم بتدويره لإذابة طبقة PVA لاستعادة أكثر من 95٪ من الجراثيم القادرة على الإنبات. استخدم الماء المعقم لتخفيف العينة بشكل متسلسل من واحد إلى 10 في صفيحة 96 بئر. بعد طلاء 50 ميكرولتر من كل تخفيف على أجار LB ، واحتضانه عند 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها ، احسب عدد المستعمرات وحدد CFUs لكل مليلتر.

لتجارب الإنبات ، قم بإعداد وسادة أجار بسمك 1.5 رطل بسمك ملليمتر واحد عن طريق غلي 700 ميكرولتر من الوسط وماصتها في مجهر معقم بدرجة. بعد 10 دقائق ، استخدم مشرطا معقما لقطع وسادة أجار بحجم ثمانية ملليمترات × ثمانية ملليمترات في ملليمتر واحد LB أجار ، وانقل الأجار بعناية فوق طبقات الأبواغ الأحادية التي ترتكز على زلات غطاء زجاجي مقاس 25 ملم مثبتة بالفعل في غرفة التصوير. تجمع طريقة وضع أجار بين وظيفتين محددتين.

يعمل على استقرار العينات في المستوى البصري أثناء الفحص المجهري بالليزر ويقيد حركة الخلايا الجانبية. بصرف النظر عن استخدامه في مقالات الإنبات ، يمكن تطبيق هذه الطريقة على الكائنات الحية الدقيقة الأخرى وكذلك على الخلايا حقيقية النواة. بعد تغطية العينة بالأجار ، انقل زلة الغطاء الزجاجي بسرعة إلى غرفة التصوير.

احتفظ بالعينة عند 37 درجة مئوية على مرحلة ساخنة أثناء عملية التصوير بأكملها. استخدم ما لا يقل عن ثلاثة مكررات بيولوجية لكل حالة. بعد تصوير العينات عن طريق المسح الضوئي بالليزر متحد البؤر الآلي والفحص المجهري للمجال الساطع ، قم بتسجيل سلسلة الفاصل الزمني بقوة ليزر تبلغ 2.6٪ وضبط الفتحة البؤرية على خمس وحدات aer وتردد عينة بإطار واحد لكل 30 ثانية من صفر إلى خمس ساعات حسب التجربة.

قد يؤدي تطبيق جرعات عالية من الضوء أحادي اللون إلى تثبيط إنبات الأبواغ تماما أثناء الفحص المجهري بالليزر. لذلك ، استخدم شدة الليزر وفترات أطول فقط للحصول على إطارات فردية. في حالة تراكم الأبواغ أو توزيع الأبواغ متعددة الطبقات أو التلوث بجزيئات الغبار ، قد يحدث انسداد لمعالجة البلازما أو التظليل وتمكين إنبات الجراثيم المظللة.

لإجراء الفحص المجهري الإلكتروني الماسح ، بمجرد ترميز طبقات الأبواغ أحادية الرش بالبلاديوم الذهبي ، قم بتصوير العينات مع انبعاث المجال SEM الذي يعمل بجهد تسارع خمسة كيلو فولت بما في ذلك كاشف الإلكترون الثانوي inlan للكشف عن تباين التضاريس. كما هو موضح في هذا الرسم البياني ، فإن العلاج بالبلازما لجراثيم B.subtilis يؤدي إلى انخفاض في البقاء على قيد الحياة مع زيادة مدة العلاج بالبلازما. تكشف صور SEM هذه عن هياكل طولية شبيهة بالتلال ، والتي تظهر باستمرار في جميع الجراثيم المعالجة وغير المعالجة.

معالجة البلازما لمدة تصل إلى 30 ثانية ، لا تؤدي إلى تغييرات كبيرة في مورفولوجيا سطح البوغ مقارنة بالضوابط. تؤدي زيادة مدة العلاج بالبلازما إلى سطح أكثر حبيبات ويمكن ملاحظة تشققات وشقوق صغيرة في الجراثيم المعالجة لمدة 120 أو 240 ثانية. في هذه التجارب المجهرية للمسح الضوئي بالليزر متحد البؤر التي تم حلها ، تنبت جميع الجراثيم تقريبا المعالجة بالفراغ كعنصر تحكم وتطور مورفولوجيا خلية على شكل قضيب بطول موحد إلى حد ما للخلايا الفردية.

في المقابل ، تظهر الجراثيم المعالجة لمدة 15 ثانية بالبلازما بالفعل قدرة إنبات منخفضة تقل عن 75 زائد أو ناقص أربعة بالمائة. بالإضافة إلى ذلك ، تنمو الخلايا إما إلى قضبان طويلة على نطاق واسع أو تظل صغيرة وتلتصق بطبقة البوغ. بعد 30 ثانية من العلاج بالبلازما ، تنبت 25 أو ناقص ستة بالمائة فقط من الجراثيم وتتأخر الخلايا الخضرية بشكل ملحوظ في النمو وتختلف في الطول.

أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم تأكيد جودة الطبقات الأحادية الأبواغ باستخدام الفحص المجهري لتباين الطور من أجل التأكد من عدم وجود جراثيم متداخلة أو نبتة. بعد تطويرها ، مهدت طريقة وسادة أجار لتثبيت الصورة الطريق للباحثين في تعقيم البلازما والفحص المجهري للخلايا الحية. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم أفضل لكيفية تحضير طبقات أحادية الأبواغ على الشرائح الزجاجية ، وتحديد الاستخدام باستخدام علاجات البلازما لتعطيل الأبواغ وإجراء الفحص المجهري الإلكتروني للخلايا الحية والمسح الإلكتروني.

على عكس طرق إزالة التلوث الأخرى ، على سبيل المثال أكسيد الإيثيلين أو إشعاع جاما ، يعد تعقيم البلازما نهجا فعالا وآمنا لتقليل عدد من الكائنات الحية الدقيقة غير المرغوب فيها على أي نوع من الأسطح تقريبا.