في فيفو حاجز الدم في الدماغ نفاذية مقايسة في الفئران باستخدام المسمى فلوريسسينتلي تتبع

الهدف العام من هذا الإجراء هو تقييم نفاذية الأوعية الدموية الدماغية في الفئران باستخدام أدوات التتبع المصنفة بالفلورسنت لتقييم الخلل الوظيفي للحاجز الدموي الدماغي في النماذج الحيوانية. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال الحاجز الدموي الدماغي المتعلقة بنفاذية الأوعية الدموية العصبية في الأمراض والتعافي منها عند العلاج. الميزة الرئيسية لهذه الطريقة هي أنها بسيطة وكمية.

إنه يعطي إمكانية التقييم المتزامن للنفاذية عن طريق القياس الفلوري ، وهو كمي ، وكذلك الفحص المجهري الفلوري للدفاعات الإقليمية. تمتد الآثار المترتبة على هذه التقنية نحو تشخيص وعلاج العديد من الاضطرابات العصبية ، بما في ذلك أورام المخ والسكتة الدماغية ومرض الزهايمر لأن هذه الأمراض مرتبطة بوذمة دماغية تهدد الحياة وتحسين وظيفة BBD كهدف علاجي رئيسي. ستظهر جزءا من الإجراء الآنسة جادرانكا ماكاس ، مسؤولة التكنولوجيا العلمية في المعهد.

حقن الفئران داخل الصفاق ب 100 ميكرولتر من محلول التتبع المليمولي. اختر أدوات التتبع القابلة للإصلاح بالليسين ، مثل dextrans المسمى FITC و TMR مع أطياف انبعاث الإثارة المميزة لتقليل التداخل بين الأصباغ. في حالة الجمع بين أجهزة التتبع ، قم بحقن 200 ميكرولتر من محلول التتبع المركب داخل الصفاق.

قم بتضمين الحقن للمركبة فقط لتكون بمثابة عناصر تحكم زائفة لطرح خلفية التألق الذاتي. بعد كل حقنة ، اترك خمس دقائق قبل تخدير الفئران بعمق وفقا للبروتوكولات المؤسسية المعتمدة. تحضير للتروية القلبية بعد 10 دقائق من إعطاء التخدير.

تحقق من عدم وجود استجابة ارتعاش المخلب للتأكد من أن الفأر قد وصل إلى مستوى التخدير الجراحي. ضع الفأر المراد نفعه على ظهره ووضع 80٪ من الإيثانول على جلد منطقة البطن. بعد استخدام مقص صغير لإنشاء شق بطول سنتيمترين في جدار البطن ، افصل الكبد عن الحجاب الحاجز ، ثم اقطع الحجاب الحاجز ببطء ، مما أدى إلى تعريض تجويف الجمع.

اقطع القفص الصدري بشكل ثنائي وقم بإصلاح قطع القص لكشف البطين الأيسر. أدخل إبرة فراشة قياس 21 متصلة بنظام التروية التمعجية في الجزء الخلفي من البطين الأيسر. ثقب الأذين الأيمن ثم استخدم طرف ماصة سعة مليلتر واحد مع قطع نهايتها لجمع 200 إلى 300 ميكرولتر من الدم المنبعث بسرعة ونقله إلى أنبوب تجميع المصل.

قم بتخزين الدم الذي تم جمعه على الثلج. بمجرد جمع الدم ، قم بتشغيل نظام التروية وقم بتفريم لمدة ثلاث دقائق باستخدام الكالسيوم بدرجة حرارة الغرفة والمغنيسيوم الخالي من الأيونات PBS. تقييم جودة التروية من خلال ملاحظة لون الكبد والكلى ، والتي تبدو شاحبة بعد التروية.

بعد حصاد الدماغ ، تحقق من عدم وجود دم مرئي في أوعية السحايا. يجب استبعاد العينة من تحليل النفاذية إذا كانت جودة التروية رديئة. استخدم مشرطا لفصل الدماغ إلى قسمين من الدماغ.

ثم قم بتشريح المخيخ والفص الشمي من نصف دماغ واحد ، وانقل نصف المخ إلى أنبوب سعة ملليلتر. ضع كلية واحدة محصودة في أنبوب آخر سعة ملليلتر. ضع العينات على الفور على الثلج الجاف.

قم بتضمين الكلى ونصف الدماغ المتبقي أصلا مع المخيخ والفصوص الشمية سليمة في مركب درجة حرارة القطع الأمثل TissueTech ، ووضعها على الثلج الجاف. أخيرا ، بعد الطرد المركزي لعينات الدم عند 10،000 جم لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية ، انقل المواد الطافية في المصل إلى أنابيب سعة 1.5 ملليلتر وضعها في وعاء الثلج الجاف. انقل العينات إلى الفريزر 80 درجة مئوية تحت الصفر حيث تزداد كفاءة التجانس بعد التجميد والذوبان.

ضع عينات نصف المخ والكلى على الجليد لإذابة الجليد ، ثم قم بوزن الأنابيب التي تحتوي على الأعضاء. من هذه الأوزان ، اطرح متوسط القيمة البالغة حوالي 20 أنبوبا فارغا للحصول على وزن الأنسجة. أضف 300 ميكرولتر من PBS البارد إلى الأنبوب الذي يحتوي على الكلى و 200 ميكرولتر إلى الأنابيب التي تحتوي على نصف الدماغ.

قم بتجانس كل عينة في أنبوب الطرد الدقيق الأصلي باستخدام مدقة PTFE متصلة بمحرك كهربائي علوي ، باستخدام حوالي 15 ضربة. قم بتخزين العينات المتجانسة على الجليد ، محمية من الضوء. اشطف المدقة باستخدام PBS بين العينات وامسحها حتى تجف قبل الانتقال إلى العينة التالية.

عندما يتم تجانس جميع العينات ، يتم استخدام جهاز الطرد المركزي لمدة 20 دقيقة عند 15،000 جم وأربع درجات مئوية. بعد الطرد المركزي ، انقل المواد الطافية إلى أنابيب جديدة سعة 1.5 مل على الجليد قبل الشروع في قياس التألق والقياس الكمي. انقل المادة الطافية إلى صفيحة سعة 384 بئرا وأدخل اللوحة في قارئ الفلورة.

تأكد من تضمين الأطوال الموجية الصحيحة للإثارة والانبعاث للمتتبع واضبط الكسب على الأمثل. ابدأ القياس، وقم بتصدير البيانات كجدول بيانات لإجراء العمليات الحسابية كما هو موضح في البروتوكول. في يوم التلوين ، قم بإذابة أقسام ناظم البرد سعة 10 ميكرون مثبتة على شرائح عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.

بعد ذلك ، قم بإصلاح الأقسام بنسبة 4٪ بارافورمالدهيد لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة ، متبوعا بالغسيل السريع في PBS. تخلل ومنع الارتباط غير المحدد في الأقسام عن طريق الحضانة في PBS معقم يحتوي على 1٪ PSA و 0.5٪ Triton X-100 لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. بعد الحظر ، احتضن الشرائح بتخفيف واحد إلى 100 من الجسم المضاد الأولي CD31 لمدة 1.5 ساعة في درجة حرارة الغرفة.

بعد الغسيل باستخدام PBS ثلاث مرات لمدة خمس دقائق لكل منها ، قم بإجراء حضانة الأجسام المضادة الثانوية لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة باستخدام الأجسام المضادة ذات العلامات الفلورية الخاصة بالأنواع. قم بتركيب الأقسام الملطخة باستخدام Aqua-Poly / Mount واتركها طوال الليل للبلمرة في درجة حرارة الغرفة في الظلام. أخيرا ، احصل على صور باستخدام نظام مجهر المسح الضوئي بالليزر متحد البؤر للتصوير الطيفي.

من أجل تحديد وقت دوران التتبع لمقايسة النفاذية ، تتم مقارنة وقت الدوران الطويل البالغ ساعتين بوقت تداول قصير يبلغ 15 دقيقة بعد حقن المتتبع. يؤدي وقت الدورة الدموية الأطول البالغ ساعتين إلى انخفاض كميات تراكم المتتبعات في الكلى مقارنة بوقت دوران قصير مدته 15 دقيقة ، ربما بسبب الخلوص العالي FITC dextran، الموضح باللون الأخضر من حجرة الأوعية الدموية. هذا التأثير أكثر دراماتيكية في الدماغ بسبب ضيق الحاجز الدموي في الدماغ.

أكد تلطيخ CD31 الذي شوهد في القناة الحمراء وجود أوعية في الكلى في كلتا النقطتين الزمنيتين اللتين تم فحصهما وفي الدماغ. بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء هذه التقنية في غضون خمس إلى ست ساعات ل 10 فئران مع عالمين يعملان جنبا إلى جنب. أثناء محاولة هذه التقنية, من المهم أن نتذكر استخدام متتبعات الوزن الجزيئي الصحيح, الرسم البياني وخصائص التألق من أجل الإجابة على الأسئلة المتعلقة بنفاذية حاجز الدم في الدماغ.

بعد هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل الكيمياء النسيجية المناعية ل BBD وملء عوامل المرض للإجابة على أسئلة إضافية ، مثل شدة موقع المرض وتوطينه.