عزل الخلايا الدبقية المعوي من سوبموكوسا والصفيحة بروبريا الماوس الكبار

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال علم الأعصاب ، وتحديدا وظيفة الجهاز العصبي المعوي. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها طريقة سريعة وغير إنزيمية لعزل الخلايا المعوية من الصفيحة المخصوصة وتحت الغشاء المخاطي بدلا من العضلات الملساء. ابدأ بتحديد المعدة البعيدة والبواب.

أمسك البواب بالملقط أثناء قص المساريق. ثم استخدم تشريحا حادا بالجزء الخلفي من المقص لكشط البنكرياس الملتصق. ثم استخدم المقص لإزالة سبعة سنتيمترات من الأمعاء القريبة دون تمزق.

ضع الجزء المعوي في DPBS المثلج بدون الكالسيوم أو المغنيسيوم. بعد ذلك ، استخدم حقنة سعة خمسة أو 10 مليلتر متصلة بإبرة غير حادة من 18 إلى 20 لغسل محتويات البراز باستخدام DPBS المثلج. قسم الأمعاء إلى ثلاثة أجزاء بحجم ثلاثة سنتيمترات لإزالة العضلة الطولية.

تعد الإزالة السريعة للعضلة المساريق والعضلات الطولية ضرورية لعزل الخلايا الدبقية المعوية الصحية عن الصفيحة المخصوصة وتحت الغشاء المخاطي. بعد ذلك ، خذ قطعة قطن واقطع حوالي أربعة سنتيمترات لفصل العصا الخشبية عن طرف القطن. انقع العصا الخشبية في DPBS.

ضع أحد أجزاء الأمعاء بسلاسة على العصا المبللة ثم استخدم ملقط أنف الإبرة لإزالة أي المساريق الملتصق المتبقي. ثم استخدم شفرة حلاقة نظيفة أو مشرط لعمل شقين طوليين على طول الأمعاء حيث تم توصيل المساريق. أمسك طرف العصا بين الإبهام والسبابة مع تثبيت الجزء بالإصبع الأوسط والرابع.

بلل طرف القطن باستخدام DPBS. افركي طرف القطن المبلل طوليا على طول العضلة لتخفيف الضفيرة المساريقية العضلية الطولية أو LMMP. ثم حرك طرف القطن أفقيا لإبعاد LMMP عن العضلة الدائرية.

عند الانتهاء ، سوف يقشر LMMP الجزء المعوي بسهولة. تخلص من LMMP ما لم يكن حصاد EGCs من الضفيرة المساريقية مطلوبا. ثم استخدم شفرة حلاقة لفتح الجزء المعوي طوليا لإزالة العصا الخشبية.

حافظ على الأنسجة المعوية المجردة التي تتكون في الغالب من الغشاء المخاطي وتحت الغشاء المخاطي بالإضافة إلى العضلات الدائرية في DPBS على الجليد. كرر التشريح للعينات الأخرى حتى يتم تحضير جميع أجزاء الأمعاء. لإزالة الغشاء المخاطي الظهاري ، استخدم أولا مقصا دقيقا لتقطيع الأمعاء إلى قطع بحجم 0.5 سم تقريبا وجمع القطع في 30 مل من محلول EDTA HEPES DPBS المثلج.

هز الأنسجة المحتوية على محلول عند أربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق بحوالي 60 إمالة في الدقيقة. قم بترطيب ماصة بلاستيكية سعة خمسة ملليلتر مسبقا عن طريق سحب المخزن المؤقت EDTA HEPES DPBS لأعلى ولأسفل مرة واحدة ثم استخدم الماصة المبللة مسبقا لترثرة الأنسجة وتعليق المخزن المؤقت 20 مرة لإخراج الغشاء المخاطي الظهاري. اجمع الأنسجة عن طريق صب الخليط في مصفاة خلية نايلون 100 ميكرون.

ثم استخدم ملقط الأنف بالإبرة لوضع الأنسجة المحتجزة في المصفاة في أنبوب طرد مركزي مخروطي جديد سعة 50 مليلتر يحتوي على 30 مل من الثلج البارد EDTA HEPES DPBS. كرر حضانة EDTA HEPES DPBS مرة ثانية عن طريق هز الأنسجة عند أربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق بحوالي 60 إمالة في الدقيقة لتجريد الغشاء المخاطي الظهاري الإضافي. قم بإجراء عملية ترتيتورية لطيفة باستخدام ماصة مبللة مسبقا سعة خمسة ملليلتر.

تميل الأنسجة إلى الالتصاق بداخل الماصة مع إزالة المزيد من الظهارة. مطلوب التجريب اللطيف في هذه المرحلة لأن الخلايا الدبقية المعوية أكثر هشاشة. اجمع الأنسجة بعد الحضانة الثانية عن طريق صب الخليط من خلال مصفاة خلية نايلون 100 ميكرون وتخلص من التدفق من خلالها.

يجب أن يكون التدفق الثاني أقل تعكرا بشكل ملحوظ من الأول. كرر حضانة EDTA لمدة 10 دقائق حتى يصبح المحلول واضحا تقريبا. انقل الأنسجة من مصفاة النايلون إلى أنبوب طرد مركزي مخروطي سعة 15 مليلتر يحتوي على خمسة ملليلتر من محلول استعادة الخلايا المتاح تجاريا.

ثم الصخور لمدة 25 إلى 30 دقيقة عند أربع درجات مئوية. ثلاثي الأبعاد برفق 10 مرات لفصل الخلايا الدبقية المعوية عن الصفيحة المخصوصة. ثم قم بالتصفية من خلال مرشح 40 ميكرون وجمع المرشح في أنبوب نظيف سعة 50 مل.

اشطف الأنسجة الموجودة على مرشح النايلون بملليلتر واحد من DPBS. تخلص من الأنسجة وانقل خمسة إلى ستة ملليلتر من المرشح إلى أنبوب طرد مركزي مخروطي الشكل نظيف سعة 15 مل. قم بتدوير المرشح عند 2 ، 000 مرة في جهاز طرد مركزي دلو متأرجح لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية.

أعد تعليق الخلية الدبقية التي تحتوي على الحبيبات في ملليلتر واحد على الأقل من المخزن المؤقت لإعادة التعليق عن طريق سحب الحبيبات برفق لأعلى ولأسفل باستخدام طرف الماصة سعة 500 ميكرولتر دون إدخال فقاعات. أخيرا ، قم بإضافة 200 ميكرولتر من تعليق الخلية في كل بئر من صفيحة ستة آبار مطلية بالصفيحة أو 100 ميكرولتر إلى كل بئر من صفيحة مكونة من 12 بئرا تحتوي على وسائط نمو دبقية. يجب اعتبار الإعداد غير ناجح إذا لم تلتصق الخلايا الدبقية المعوية وتنتشر في غضون 24 ساعة كما هو موضح هنا.

فيما يلي مثال تمثيلي على إعداد ممتاز بعد 24 ساعة من عزل الخلية وإعادة تعليقها حيث تلتصقت الخلايا الدبقية المعوية في بقع بلوحة PDL المغلفة بالصفيحة. يمكن تحديد عدد الخلايا الدبقية بعد 24 ساعة عندما تلتصق الخلايا وتعرض دليلا على الانتشار في مجاميع مسطحة. تميل الخلايا الموجودة على حافة العناقيد إلى تمديد العمليات الطويلة والتعبير عن العلامات الدبقية الكلاسيكية مثل GFAP و S100B و p75NTR.

بعد هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل الكيمياء المناعية ، والبقع الغربية ، وقياس التدفق الخلوي ، وتصوير تدفق الكالسيوم من أجل الإجابة على أسئلة إضافية حول عدم تجانس الخلايا الدبقية المعوية. بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين الذين يدرسون الجهاز العصبي المعوي لاستكشاف بيولوجيا الخلايا الدبقية وتأثيرها على الغشاء المخاطي المجاور والجراثيم في الفئران وبالتالي في البشر.