التحقيق إكسون الثدييات التجديد: في فيفو انهانسر من العقدة الجذر الظهرية الماوس الكبار

انهانسر نهج فعال لتوصيل الجينات المصالح إلى الخلايا. بتطبيق هذا النهج في فيفو على الخلايا العصبية العقدة الجذر الظهرية الماوس الكبار (DRG)، يصف لنا نموذجا لدراسة إكسون التجدد في فيفو.

توفر هذه الطريقة تقنية تعداء الجينات في الجسم الحي لمعالجة التعبير الجيني في الخلايا العصبية الحسية للفأر البالغ للدراسات المستقبلية لتجديد الثدييات الخارجية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها أقل عمالة وتستغرق وقتا طويلا ، ويمكنها الإفراط في التعبير عن الجينات المستهدفة وإسقاطها في وقت واحد وبشكل منفصل. لبدء هذا الإجراء ، ضع علامة على جانبي القمة الحرقفية للفأر المخدر بقلم تحديد دقيق.

ارسم خطا يربط نقطتين من القمة الحرقفية لتسهيل تحديد مواضع L5 DRGs. ثم قم بعمل شق بطول ثلاثة سنتيمترات على طول خط الوسط لأسفل الظهر باستخدام مقص صغير. بعد ذلك ، افصل العضلات الطفيلية ، مثل العضلي المتعدد والعضلات الطويلة القطنية ، من العمليات الشائكة L3 إلى S1 ، وفضح مفصل اللفافة في L4-5 و L5-6.

بعد ذلك ، استخدم rongeur الصغير لإزالة مفاصل اللفافة في L4-5 و L5-6. بعد ذلك ، قم بإزالة القوس العصبي الأيسر ل L4 و L5 ، لفضح الجانب الظهري من DRGs. لحقن DRG ، قم بتحميل بلازميدات الحمض النووي أو أوليغوس الحمض النووي الريبي في الماصة الشعرية الزجاجية.

بعد ذلك ، أدخل طرف الماصة الزجاجية الشعرية ، بعناية ، في DRG ، وقم بحقن محلول ميكرولتر واحد تدريجيا من بلازميدات الحمض النووي أو قلة الحمض النووي الريبي باستخدام نظام توزيع الحقن الدقيق داخل الخلايا. للتثقيب الكهربائي ، اضغط على DRG المستهدف باستخدام الأقطاب الكهربائية برفق ، وقم بتطبيق خمس نبضات كهربائية مربعة مع نظام التثقيب الكهربائي. بعد ذلك ، أغلق العضلات ، ثم طبقات الجلد بخيوط النايلون.

بعد يومين أو ثلاثة أيام من التثقيب الكهربائي DRG ، قم بتخدير الفأر داخل الصفاق ، وقم بلصق أطرافه على لوح الفلين ، وقم بعمل شق سنتيمتر واحد 0.5 سم إلى الجانب الأيسر على طول خط الوسط. بعد ذلك ، قم بقطع العضلات ، مثل عضلات الألوية الكبيرة والعضلة الكمثرية ، طوليا. ثم ، قم بكشف جزء من العصب الوركي بين الثقبة الوركي الأكبر والشق الوركي.

سحق العصب باستخدام ملقط الجراحة المجهرية لمدة 12 ثانية ، وقم بتمييز موقع السحق بخياطة نايلون لاينور. بعد ذلك ، أغلق طبقات العضلات والجلد بخياطة من النايلون. بعد الوفرة ، افصل DRGs مع جذور الأعصاب والعصب الوركي ، بعناية ، باستخدام مقص دقيق وملقط دقيق تحت مجهر التشريح.

بعد ذلك ، انقل العصب الوركي مباشرة في 4٪ PFA بين عشية وضحاها عند أربع درجات مئوية. لتصوير وقياس المحاور الحسية المضنية تحت مجهر التشريح ، قم بتجريد الأنسجة والغشاء المرفقين على العصب الوركي الثابت باستخدام مقص دقيق وملقط دقيق بعناية. ثم اغسل العصب باستخدام PVS ثلاث مرات.

بعد ذلك ، ضع العصب الوركي على شريحة واحتفظ به مستقيما. أضف 80 ميكرولترا من المحلول المضاد للبهتان حول العصب ، ثم ضع زلة غطاء عليه. تسطيح الأنسجة المثبتة بالكامل بالضغط.

بعد ذلك ، ضع الأنسجة المسطحة تحت مجهر epifluorescence المقلوب ، المجهز بملحق للحصول على الفسيفساء ومعالجة الصور. عند قياس طول المحاور المتجددة ، تتبع جميع المحاور المصنفة بالفلورسنت التي يمكن تحديدها في العصب الوركي من موقع السحق إلى نهايات المحور العصبي البعيدة. عند تطبيق طريقة التثقيب الكهربائي الحالية في الجسم الحي لدراسة التجديد المحوري ، تم تسطيح العصب الوركي وتصويره.

تتبع كل محور عصبي متجدد بمسار مميز ونهاية محورية بعيدة يمكن التعرف عليها من موقع السحق المشار إليه بواسطة عقدة الخياطة. يشير رأس السهم الأبيض والسهم والنجمة إلى ثلاثة نهايات محورية مميزة ، تمتد جميعها من موقع السحق. بالإضافة إلى ذلك ، تم تزويد DRGs بالكهرباء باستخدام بلازميدات EGFP ، وتم حصاد الحبل الشوكي.

تم تصوير محاور العمود الظهري المسماة EGFP ، في الحبل الشوكي ، وتحديدها في كل من الصور الإسقاط الطولية والسهمية. فيما يلي عرض مفصل للمحاور العصبية في العمود الظهري ، وإليك عرض مفصل للمحاور العصبية في منطقة دخول الجذر الظهري. تظهر هذه الصورة الإسقاط السهمي للمحاور المسماة EGFP داخل العمود الظهري.

بدلا من ذلك ، يمكن معالجة الصور متحدة البؤر باستخدام برنامج تصور المجهر لإعادة بناء صورة ثلاثية الأبعاد. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر وضع L4 و L5 DRGs بشكل صحيح ، وعمل عقدة على الغشاء الجافوي دون وخوزة العصب الوركي ، مع وضع علامة على موقع السحق بعقدة خياطة. بعد تطويرها ، تمهد هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال تجديد المحاور العصبي لاستكشاف الجينات المطلوبة ل PNS ، أو تجديد المحاور العصبي الطبيعي ، أو الجينات التي يمكن أن تعزز التجديد في الفئران البالغة في الجسم الحي.