عزل و₁-ATPase من "طلائعيات طفيلية" المثقبيات البروسية

يصف هذا البروتوكول تنقية إف₁-ATPase من مرحلة الحشرات مثقف المثقبيات البروسية. الإجراء غلة معقدة جداً نقية ومتجانسة ونشط مناسبة لدراسات هيكلية والانزيميه.

ويستند تنقية F1-ATPase على الطرق الكيميائية الحيوية الكلاسيكية التي ثبت أن تكون حاسمة لفهمنا لآلية إنتاج ATP من قبل synthases ATP الأخرى. والميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تنتج إنزيما نقيا للغاية ومناسبا لتحديد الهيكل عن طريق التصوير البلوري بالأشعة السينية أو المجهر الإلكتروني المبرد. على الرغم من أن هذا البروتوكول هو الأمثل لعزل F1-ATPase من المثقبيات، فإنه يمكن تكييفها لمصادر أخرى، مثل الأنسجة أو الخلايا الثقافية، وإلى مختلف ضمائر المسببة للأمراض.

وقد تؤدي هذه التقنية إلى تحديد أدوية جديدة لعلاج الأمراض البشرية الحادة. على سبيل المثال، مرض السل الميكوبتريا F-ATPase هو هدف المخدرات الموثقة لعلاج السل. لبدء البروتوكول، ذوبان وتجميل بلطف الحويصلات الميتوكوندريا، والمعروف أيضا باسم البلاستك، معزولة سابقا من قبل تحلل هابوتوني من مرة واحدة 10 إلى 11 إلى مرتين 10 إلى الخلايا 11 من procyclic Trypanosoma بروسي في خمس ملليلتر من الجليد الباردة العازلة A.Keep العينة المبردة.

المقبل, تحديد تركيز البروتين في التعليق من قبل حمض bicinchoninic, أو BCA, تحليل البروتين وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. قم بإجراء سلسلة تخفيف BSA في المياه النقية للغاية لبناء المنحنى القياسي. تخفيف كمية صغيرة من العينة 20 إلى 100 مرة مع المياه النقية جدا لتناسب مجموعة من معايير BSA.

بعد حساب كمية البروتين الإجمالية في العينة، وجلب تركيز البروتين إلى 16 ملليغرام لكل ملليلتر عن طريق تمييع ذلك مع المخزن المؤقت A.Then جزء من العيّنات إلى vesicles مقلوب وقطع الغشاء عن طريق سونيكيشن سبع مرات لمدة 15 ثانية لكل منهما، مع طاقة إجمالية من 70 إلى 100 جول لكل دفعة مع ميكروتيب بقطر 3.9 ملليمتر. أثناء التفتت، احتضان العينة على الجليد لمدة 30 ثانية بين النبضات. بعد سونيكيشن، قد يبدو التعليق أغمق قليلا.

ترسب شظايا الغشاء عن طريق الطرد فوق المركز في 54، 000 غرام لمدة 16 ساعة أو في 98،000 غرام لمدة خمس ساعات في أربع درجات مئوية. Decant المابير والمضي قدما في استخراج الكلوروفورم. حساب حجم المخزن المؤقت B استناداً إلى إجمالي مقدار المخزن المؤقت A المستخدمة.

نقل الرواسب المجمدة من أنبوب الطرد المركزي إلى المهيج. Resuspend بيليه من الأغشية الميتوكوندريا في العازلة B بمساعدة من التجانس Dounce الصغيرة. نقل تعليق إلى أنبوب مخروطي 50 ملليلتر.

إزالة العينة من الجليد، والحفاظ على العينة وجميع الحلول في درجة حرارة الغرفة للخطوات المتبقية. ثم إضافة الكلوروفورم المشبعة مع اثنين من تريس الضرس تعديلها مع حمض الهيدروكلوريك إلى 8.5 pH، واحد إلى واحد. أغلق الغطاء بإحكام، واهز العينة بقوة لمدة 20 ثانية بالضبط.

فورا الطرد المركزي الخليط في 8، 400 غرام لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك، قم بنقل المرحلة العلوية المائعة الغائمة إلى 1.6 ملليلتر من الأنابيب الدقيقة. إضافة مثبطات البروتياز إلى العينة لتحل محل مثبطات إزالة العلاج الكلوروفورم.

أجهزة الطرد المركزي العينات في 13، 000 غرام لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد الدوران، نقل supernatant إلى الأنابيب الدقيقة الطازجة، وتكرار الطرد المركزي لإزالة أي مادة غير قابلة للذوبان المتبقية. اكويبيرت في تبادل أنيون خمسة ملليلتر Q العمود تعلق على نظام كروماتوغرافيا السائلة البروتينية السريعة مع 50 ملليلتر من Q عمود العازلة بمعدل تدفق من خمسة ملليلتر في الدقيقة حتى امتصاص في 280 نانومتر واستقرار الموصلية.

قم بتحميل المُنَافق فوق العمود المُعدل بمعدل تدفق قدره ملليلتر واحد في الدقيقة. انتظر حتى الامتصاص في 280 نانومتر يستقر في الخلفية. تطبيق تدرج خطي 25 ملليلتر من عمود Q العازلة من 0٪ إلى 100٪ بمعدل تدفق 0.5 ملليلتر في الدقيقة وجمع الكسور ملليلتر واحد.

مقايسة 10 ميكرولترات من كل كسر الفردية المقابلة لذروة elution الرئيسية ل ATP النشاط المائي في المليلتر من خليط التفاعل من قبل مقايسة ATPase بولمان في درجة PH 8.0. تجمّع الكسور التي تعرض نشاط ATPase. تركيز العينة المجمعة عن طريق الترشيح الفائق الغشاء باستخدام عمود تدور مع 100،000 الجزيئية خفض الوزن PES مرشح إلى 200 إلى 500 ميكرولترات.

ثم انتقل إلى حجم استبعاد الكروماتوغرافيا. اكويبير العمود زيادة 6 سوبروز تعلق على نظام الكروماتوغرافيا السائل مع ما لا يقل عن 48 ملليلتر من العازلة SEC بمعدل تدفق 0.5 ملليلتر في الدقيقة الواحدة. تطبيق النموذج إلى العمود.

تشغيل الكروماتوغرافيا بمعدل تدفق 0.25 ملليلتر في الدقيقة الواحدة، مع جمع 0.25 ملليلتر الكسور. بعد ذلك، تشغيل 10 ميكرولترات من الكسور التي تتوافق مع قمم الأشعة فوق البنفسجية 280 نانومتر امتصاص تتبع على SDS-PAGE. ثم وصمة العينات مع Coomassie الأزرق.

مقايسة الكسور المقابلة لأول قمة رئيسية تحتوي على ذروة F1 للنشاط ATP الهيدرولوجي وحساسية الأزيدية من قبل تحليل بولمان ATPase. ثم إجراء فحص BCA لتحديد تركيز البروتين. وأخيرا، والحفاظ على F1-ATPase تنقية في درجة حرارة الغرفة، واستخدامها في غضون ثلاثة أيام بعد تنقية لتطبيقات المصب.

يعرض هذا الملف الجانبي للتصوير اللوني لـ Anion Exchange امتصاص الأشعة فوق البنفسجية عند 280 نانومتر وتركيز كلوريد الصوديوم في عازلة الاستيرويد. تم فصل الكسور المختارة على هلام SDS-PAGE وملطخة بصبغة Coomassie Blue. تم تجميع الكسور التي تتوافق مع ذروة elution الرئيسية من الكروماتوغرافيا التبادل anion وتحتوي على F1-ATPase، وركزت، واستخدمت كمدخلات ل اللوني اقصاها حجم.

الملوثات الرئيسية هي ديهيدرولبوليل ديهيدروجيناز، الذي يسيل من العمود الكروموغرافيا الحجم استبعاد كذروة منفصلة. وF1-ATPase elutes في أول قمة مهيمنة، إلى حد كبير متماثل. يظهر تلطيخ Coomassie Blue لنمط نطاق نموذجي بعد فصل F1-ATPase المنقى عبر SDS-PAGE نطاقات ضعيفة متفرقة مرئية فوق نقطة بيتا الفرعية ، والتي تمثل مجموعات فرعية من ألفا ثلاثة قطع رأس بيتا ثلاثة ، وخافترات وأوليجومرات من الوحدات الفرعية ألفا وبيتا ، وخالية من أي ملوثات يمكن اكتشافها بواسطة الطيف الكتلي.

أثناء إجراء استخراج الكلوروفورم ، وهي الخطوة الحاسمة للبروتوكول ، من الضروري أن تهز العينة بقوة وتمضي قدماً في فصل الطرد المركزي للمراحل العضوية والمائية على الفور. بعد هذا الإجراء، يمكن أن تتميز F1-ATPase المعزولة بالتفصيل بواسطة قياس الطيف الشامل. علاوة على ذلك، يمكن استخدامه في مقايسات النشاط أو للدراسات الهيكلية، إما من تلقاء نفسها أو في وجود مثبطات مختلفة أو التناظرية الركيزة.