في فيفو اثنين-فوتون تصوير الخلايا العصبية القشرية في الفئران حديثي الولادة

نقدم في فيفو اثنين-فوتون التصوير البروتوكول للتصوير قشرة الدماغ الفئران حديثي الولادة. هذا الأسلوب مناسبة لتحليل الديناميات التنموية من الخلايا العصبية القشرية، الآليات الجزيئية التي تتحكم في ديناميات الخلايا العصبية، والتغيرات في ديناميات الخلايا العصبية في نماذج المرض.

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في علم الأعصاب، وخاصة تلك المتعلقة بتكوين مآخذ الخلايا العصبية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أن الباحثين يمكنهم تحليل التغيرات المورفولوجية للخلايا العصبية الفردية في الفئران الوليدية الحية. تبدأ مع تخدير يوم ما بعد الولادة خمسة الجرو والمضي قدما فقط في غياب رد فعل على اختبار قرصة الذيل.

أولاً، تعقيم فروة الرأس عن طريق مسحها بنسبة 70٪ من الإيثانول. ثم، استخدام مقص تعقيم مع 70٪ الإيثانول لإزالة ما يقرب من 20 ملليمتر مربع من الجلد التي تغطي الجمجمة. بعد ذلك ، استخدم ملقطًا معقمة ومسحة قطنية نظيفة غارقة في عازل القشرة ، لإزالة اللفافة للجمجمة.

استخدم طرف التحميل لتطبيق لاصق الأنسجة على سطح الجلد المتقزّم لوقف النزيف مع تجنب المنطقة التي سيتم تصويرها. وضع الجرو على وسادة تدفئة أخرى، تعيين إلى 37 درجة مئوية، والسماح لها للتعافي من التخدير. انتظر حوالي 30 دقيقة حتى يجفف النسيج اللاصق ويتوطد.

بمجرد أن يجف لاصق الأنسجة ، ابدأ إعداد نافذة الجمجمة على الماوس المُعاد تخديره. تطبيق قطرة واحدة من عازلة القشرة على الجمجمة، ثم استخدام شفرة حلاقة معقمة لفتح بعناية منطقة قطرها ملليمتر واحد من الجمجمة، وترك دورا سليمة. تطبيق عازلة القشرة للحفاظ على سطح الدماغ رطبة.

استخدام قطعة صغيرة من الإسفنج الجيلاتين غارقة في عازلة القشرة لوقف أي نزيف. استخدام قطعة جديدة لضغط جانب واحد من استئصال القحف واستنزاف أي العازلة والدم من سطح الدجال دون لمس دورا. هذه هي الخطوة الأكثر أهمية لإعداد إطار واضح.

يجب أن تكون دورا غير التالفة ويجب إزالة الفرشاة من dura المكشوفة. بعد ذلك ، استخدم طرف ماصة لتطبيق طبقة رقيقة من واحد في المئة من agarose منخفض الذوبان ، مذابة في عازلة القشرة. تطبيق جولة، ثلاثة ملليمتر غطاء الزجاج زلة على طبقة هلام agarose.

إزالة جميع الفقاعات بين زلة الغطاء وطبقة جل agarose عن طريق صب ما يزيد على هلام agarose بينهما. استخدم الملاقط لإزالة الجل الزائد، جاحظ من تحت زلة الغطاء. مزيج مسحوق الاسمنت وسائل الاسمنت.

استخدمي طرف ماصة لتطبيق الخليط على الجمجمة قبل أن يصبح مُتَجَدَّدًا. ثم، إرفاق شريط التيتانيوم المخصصة إلى العظام القحفية باستخدام أسمنت الأسنان. محاذاة شريط التيتانيوم، وغطاء زلة بالتوازي لالتقاط الصور بسهولة.

تغطية الجمجمة المكشوفة مع أسمنت الأسنان. ثم، حقن تحت الجلد مسكن. وضع الجرو في قفص الانتعاش على وسادة الحرارة 37 درجة مئوية لمدة ساعة حتى الاسمنت الأسنان قد توطدت.

لبدء التصوير، قم أولاً بتعيين الطول الموجي بالليزر ذي الفوتين. لإثارة RFP، استخدم طول موجة من 1000 نانومتر. مسح سطح زلة الغطاء مع 70٪ الإيثانول.

إرفاق الجرو تخدير إلى لوحة التيتانيوم على مرحلة التصوير، وذلك باستخدام شريط التيتانيوم. استخدام مرحلة goniometer، لضبط الرأس، بحيث زلة الغطاء موازية للعدسة الهدف. الحفاظ على درجة حرارة الجسم من الجرو أثناء التصوير باستخدام وسادة التدفئة تعيين إلى 37 درجة مئوية وخفض تركيز isoflurane إلى 0.7٪ إلى 1٪ ضع مرحلة التصوير تحت عدسة الهدف 20x من المجهر الفوتون اثنين.

ضع قطرة ماء واحدة على زلة الغطاء. تعيين البرنامج للحصول على الصور Z المكدس في فواصل زمنية 1.4 ميكرون. لطبقة أربعة التصوير العصبي، تعيين عرض Z إلى ما بين 150 و 300 ميكرون لتصوير مورفولوجيا التشعب بأكملها.

استخدام المسح الضوئي بطيئة ومتوسط للحصول على صور واضحة تظهر مورفولوجيا الخلايا العصبية. وعادة ما يستغرق أكثر من 20 دقيقة للحصول على مورفولوجيا التشعب بأكمله. تُظهر هذه الصورة صورة تمثيلية من Z-stack للطبقة الأربعة الخلايا العصبية القشرية للجرو P5.

السهم يشير إلى الخلايا العصبية التي سيتم تحليلها. الخلايا العصبية مع dendrites غير واضحة ينبغي إزالتها من التحليل. تُظهر هذه الصورة صورة تكبير أعلى للخلايا العصبية المشار إليها في الصورة السابقة.

تشير رؤوس الأسهم الزرقاء إلى تلميحات التشعب التي سيتم سحبها عند نقطة الوقت التالية، وتشير رؤوس الأسهم البيضاء الصغيرة إلى محور عصبي للخلية المجاورة. بعد 4.5 ساعة، يتم سحب النصائح التشعبية مع رؤوس الأسهم الزرقاء، ويتم ممدود نصائح التشعب مع رؤوس الأسهم الصفراء. يظهر إعادة بناء مورفولوجيا التشعب التمثيلية هنا ، والخلايا العصبية التي تظهر التشعبات المنفصلة كما رأينا هنا ، يجب استبعادها من التحليلات.

أثناء محاولة هذا الإجراء، من المهم الحفاظ على الجافية سليمة، أثناء العملية. باستخدام هذا الإجراء، يمكن تنفيذ طرق أخرى مثل التصوير الدفعي للإجابة على أسئلة إضافية تتعلق بنمط نشاط الخلايا العصبية في الدماغ الوليدي.