Name: السابقين فيفو الجهاز القرنية الثقافة النموذجية لالتئام الدراسات (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-15T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 46 s
Description: تعلم نموذج زراعة الأعضاء القرنية خارج الجسم الحي لدراسة التئام الجروح باستخدام عيون الخنازير. يتيح هذا النموذج تقييم تأثيرات العوامل المختلفة على الشفاء التجددي والسمية الدوائية في بيئة ثلاثية الأبعاد.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

هذا العمل كان يدعمها EY024942 R01 نيي المعاهد الوطنية للصحة، البحوث "منع العمى"، شمال ولاية الطبية جامعة غير المقيد أموال البحث، ومنطقة الليونز 20-يوسف مجهرية وتحليل الصور من مقاطع البارافين أجريت في "صميم مجهرية" و إعداد شرائح نسيجية أنجز في بيوريبوسيتوري وعلم الأمراض الأساسية في "مدرسة الطب آيكان" في جبل سيناء.

1-الجهاز الثقافة
<ol><li>
الأعمال التحضيرية
	<ol>
<li>إعداد أجار الحل كما يلي. وفي قارورة صغيرة، تعد أجار 1% و 1 ملغ/مل من الكولاجين البقري في دميم-F12 يصل إلى 20 مل. جلب ليغلي على طبق ساخن. وضع الحل في أنبوب 50 مل مخروطية الشكل. ضع الأنبوبة في حمام مائي على لوحة الساخن للحفاظ على الحل من ترسيخ.</li>
		<li>تحضير الوسائط الحرة المصل المكملة (سفم) وفقا لتكوين المنصوص عليه في الجدول للمواد. ملاحظة: المبلغ اللازم من سفم سيعد يعتمد على عدد القرنيات بحيث تتم معالجتها. عادة ما يكون 30 مل وسائط كافية للقرنيات 4.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
تشريح ملاحظة: تنفيذ هذه الخطوة في غطاء تشريح أو غطاء كيميائية. يتم شحنها في العيون مع أغطية لا تزال تعلق في أكياس فردية لحماية الكرات.<ol>
<li>إزالة الكرات من أغطية مع شفرة حافة مستقيمة جراحية على لوح تقطيع تنظيفها الإيثانول. إزالة الأنسجة الدهنية الزائدة من العين باستخدام شفرة أو مقصات صغيرة (الشكل 3 أ، 3).</li>
		<li>بعد إزالة الكرة الأرضية من الغطاء، عقد العالم جيدة مع الملقط وتراجع فورا العين في مخزنة الفوسفات المالحة (PBS). وتراجع بسرعة x 3 في اليود 10% (في كوب 100 مل). وتراجع بسرعة x 2 في برنامج تلفزيوني (~ 100 مل في كوب، تغيير برنامج تلفزيوني في كثير من الأحيان).</li>
		<li>استخدام منشفة نظيفة أو الأنسجة، التفاف العين circumferentially مع ما يكفي من الضغط على سطح القرنية مشدود قطع مع ترفين. ملاحظة: الحرص على منع منشفة أو الأنسجة من الاتصال بالقرنية.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
مما أدى إلى إصابة
	<ol>
<li>استخدام ترفين 6 مم للجرح وسط القرنية. اختراق ظهارة وسدى الأمامي دون جرح سمك كامل من خلال القرنية كاملة. ملاحظة: إذا كان يتم اختراق البطانة، سيتبين فقدان الضغط وتسرب السوائل. وفي هذه الحالة يجب أن يتم تجاهل العين.</li>
		<li>ترفين في وسط القرنية، تدويره 180 درجة عكس اتجاه عقارب الساعة وعقارب الساعة 5 x (في كل مرة يتم تغيير الاتجاه أنه سيتم حساب كمرة واحدة) أثناء تطبيق الضغط الخفيف لتعميق الجرح. ملاحظة: الآن يجب أن يكون الجرح عميق ما يكفي للسماح رفرف أنسجة برفع استخدام زوج من الملقط. إذا كان هذا ليس هو الحال تكرار الخطوة 1-3-2.</li>
		<li>رفع رفرف من الحواف. في الوقت نفسه، أما باليد الأخرى أو مع شخص ثان، استخدم شفرة، خفض مواز للعالم لقطع الأنسجة كما الملقط الاستمرار في رفع قبالة القرنية الأمامية ضمن الهامش الجرح. وفي ختام هذه الخطوة ينبغي أن يكون هناك جرح دائري يقع في مركز القرنية (انظر الشكل 3 جيم، 3D).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
قطع وإزالة القرنية من أنحاء العالم
	<ol>
<li>عقد العين مع الأنسجة، جعل شق صغير 1 ملم بعيداً عن الحافة القرنية مع شفرة حيث يتم تضمين ليمبوس في ثقافة الجهاز.</li>
		<li>باستخدام الصغيرة، الوصول إلى مقص حاد شق بإنشائه في الخطوة السابقة قطع جميع أنحاء العالم، الاحتفاظ بهامش ملليمتر في جميع أنحاء القرنية للحفاظ ليمبوس سليمة.</li>
		<li>وضع القرنية في صحن 60 ملم مع 1 مل من برنامج تلفزيوني، الجانب الجرح لأسفل حتى المتصاعدة.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
تصاعد
	<ol>
<li>تأكد من أجار وصلت إلى درجة حرارة دافئة (حوالي 25 درجة مئوية).</li>
		<li>مع اثنين من أزواج من الملقط، إنشاء كوب بعقد الجانبان القرنية مع الجانب بطانية. إضافة حل أجار ارتفعت درجة حرارة تصل إلى القرنية باستخدام ماصة نقل عقيم حتى أنها كاملة.</li>
		<li>بعد أن يصلب أجار (عادة حوالي 30-45 ثانية) بعناية الوجه القرنية مع أجار إلى لوحة 60 ملم (رقم 3E). وتغطي بغطاء.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
الحضانة
	<ol>
<li>إضافة 4 مل سفم إلى اللوحة، الحفاظ على القرنيات في واجهة الهواء السائل على الحدود حوفي في 5% CO2 في 37 درجة مئوية. تحديث وسائل الإعلام بعد 24 ساعة وبعد ذلك مرة كل يومين. ملاحظة: إذا كان أداء تعداء داخل الجرح، حذف المضادات الحيوية حتى بعد تعداء.</li>
		<li>الرطب على سطح القرنية مرة واحدة يوميا بإضافة 1 قطره سفم من وسائل الإعلام مكيفة في الطبق للحفاظ على رطوبة. لهذا، تأخذ الطبق خارج الحاضنة ووضعه تحت غطاء محرك السيارة، وإزالة غطاء صحن، الرطب السطح مع وسائل الإعلام من طبق استخدام ماصة معقمة، تغطية مرة أخرى ووضعها مرة أخرى في الحاضنة.</li>
		<li>للجينات ضربة قاضية، علاج الجرح باستهداف الجين أو التحكم في siRNA هو الرصاصية إلى ناقل بوساطة الدهن حسب تعليمات المورد (انظر أدناه).</li>
		<li>مزيج 5 ميليلتر (50 بمول) من siRNA إلى 50 ميليلتر من المصل خفض الحد الأدنى الوسائط الأساسية (على سبيل المثال.، غروب-الفنزويلية). ميكس 2 ميليلتر من تعداء الكاشف إلى 50 ميليلتر من المصل خفض وسائل الإعلام. ترك هذا الجلوس لمدة 5 دقائق وثم مزجها.</li>
		<li>إضافة 200 ميليلتر من الوسائط المصل خفض الحد الأدنى إلى خليط كاشف/siRNA.</li>
		<li>"الماصة؛" دروبويسي على الجرح واحتضانها ح 3.</li>
		<li>تغسل siRNA من سطح القرنية مع وسائل الإعلام في الطبق. تغيير الوسائط حضانة سفم + المضادات الحيوية (انظر الجدول للمواد). تستمر الحضانة كما ذكر سابقا (الخطوات 1.6.1-1.6.2).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2-علم الأنسجة: مقاطع البارافين وإيمونوستينينج
<ol><li>
إعداد الأنسجة
	<ol>
<li>وبعد أسبوعين حضانة، إذا كان استخدام بعض الأنسجة لكمية الوقت الحقيقي بوليميريز سلسلة من ردود الفعل (قرة-PCR) التحليل، قبل تحديد، قص القرنية في النصف من خلال الجرح. مكان هذا النصف أو ¼ فقط (أما هو ما يكفي من الأنسجة) إلى استقرار كاشف حماية الجيش الملكي النيبالي.</li>
		<li>استخدام مجموعة أدوات قياسية عزلة، عزل الحمض النووي الريبي وأداء بكر قرة. ملاحظة: وبدلاً من ذلك، الجزء الجرحى فقط يمكن عزل واختبار للتعبير الجيني.</li>
		<li>مكان الآخر نصف القرنية في أشرطة علم أمراض الأنسجة، وتغرق في مثبت (10% فورمالين) لمدة 2-4 أيام في درجة حرارة الغرفة (RT).</li>
		<li>البارافين تضمين هذا نصف الجرحى القرنية باستخدام التقنيات القياسية. ملاحظة: توجيه القرنية الجرحى لضمان أن تسفر تقطيع الأنسجة شريحة من القرنية.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
إيمونوستينينج باستخدام 3، 3 '--ديامينوبينزيديني (DAB)
	<ol>
<li>
1 يوم
		<ol>
<li>تسمية الشرائح بشكل صحيح باستخدام قلم رصاص. دي بارافينيزي الأنسجة بوضع الشرائح في جرة مع مسح عامل (التغييرات 2، 10 دقيقة).</li>
			<li>ترطيب الأنسجة بنقل الشرائح إلى إيثانول في خفض تركيزات (100%، 100%، 70%، 50%، dH2س، dH20، 5 دقائق لكل تغيير).</li>
			<li>إجراء استرداد مستضد مايكرويف الشرائح في جرة بلاستيكية مع سترات المخزن المؤقت (10 ملم، ودرجة الحموضة 6.4) لمدة 5 دقائق. أولاً دورة 5 دقيقة بقوة 50%. إعادة ملء الجرة مع المخزن المؤقت لسترات وتكرار. يبرد لمدة 10 دقائق.</li>
			<li>أغسل x 3 مع برنامج تلفزيوني، 2 دقيقة. بيرميبيليزي الأنسجة مع % 1 X-100 تريتون في برنامج تلفزيوني 10 دقيقة في كتلة الرايت الجزأين مع 3% الماعز العادي المصل (خ ع) ح 1 في RT في الغرفة الرطبة.</li>
			<li>احتضان الأنسجة بجسم الأولية (1: 100 أو كما يوحي المورد) في 3% خ ع بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية (300 ميليلتر كل شريحة).</li>
		</ol>
</li>
		<li>
2 يوم
		<ol>
<li>شطف الشرائح x 3 مع ببست (برنامج تلفزيوني بالإضافة إلى 1% 20 توين)، 2 دقيقة. وضع الشرائح في 3 ٪ ح2س2 ل 10 دقيقة لكتلة البيروكسيديز الذاتية. أغسل x 3 مع ببست، 2 دقيقة. احتضان الأقسام مع جسم الثانوي (1: 250) برنامج الصحة الإنجابية في 3% خ ع عن ح 1 في الرايت (300 ميليلتر كل شريحة).</li>
			<li>تغسل شرائح 3 x PBST، 2 دقيقة. التعامل مع الشرائح مع عدة الدأب. إضافة 300 ميليلتر/الشريحة للحد الأدنى 3 يغسل الشرائح مع dH2س 2 x (الانخفاضات السريعة).</li>
			<li>كونتيرستين مع توضع ليغسل س. 20 الشريحة مع dH2س 2 x (الانخفاضات السريعة). وصمة عار مع وكيل لالتشطيب شطف س. 20 درهم2س للأنسجة ديهيدراتي س. 20 بوضع الشرائح في زيادة تركيزات إيثانول (50%، 70%، 100%، 100%، جميع الانخفاضات السريعة).</li>
			<li>الجاف للشرائح على منشفة ورقية تحت غطاء محرك السيارة لمدة 10-20 دقيقة.</li>
			<li>تحميل الشرائح باستخدام 1 قطره من تركيب وسائط، الغطاء مع ساترة. التسمية ومخزن في الرايت</li>
			<li>صورة الشرائح تحت مجهر، والتحديد الكمي لإشارة البث الإذاعي الرقمي مع إيماجيج7 (انظر القسم 4).</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
إيمونوستينينج: الأسفار
	<ol>
<li>في يوم 1 اتبع الخطوات الموضحة في الخطوة 2.2.1. نفذ الخطوات التالية في اليوم 2.</li>
		<li>شطف الشرائح x 3 في ببست لكل 2 دقيقة. احتضان الأقسام مع معلم fluorophore جسم الثانوية في 3% خ ع (1: 200) ح 1 في الرايت</li>
		<li>أغسل 3 x في ببست، 2 دقيقة. تحميل الشرائح باستخدام 1 قطره 4, 6-دياميدينو-2-فينيليندولي (DAPI) تركيب وسائل الإعلام وتغطية مع ساترة. الجافة في منشفة ورقية تحت غطاء محرك السيارة للحد الأدنى 30 مخزن في الظلام في 4 درجات مئوية حتى تصوير الأسفار.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
تحديد مقدار استخدام "ي الصورة"
	<ol>
<li>تحميل إصدار "فيجي" إيماجيج، التي تشمل الإضافات اللازمة للبث الإذاعي الرقمي تلطيخ القياس الكمي.</li>
		<li>فتح صورة في فيجي وحدد صورة ← لون ← Deconvolution اللون.</li>
		<li>حدد "ح ربت" كوصمة عار وثم انقر فوق موافق. وسوف تظهر ثلاث صور جديدة. حدد الصورة التي تحتوي على تلطيخ الدأب فقط.</li>
		<li>لتحديد مقدار stromal تلطيخ فقط، استخدم الدالة ممحاة ImageJ لإزالة صورة الدأب الظهارة.</li>
		<li>حدد تحليل ← قياس (أو Ctrl + M) وسجل القيمة.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

الكتاب يعلن أن لديهم لا تضارب المصالح المالية.

ويصف هذا البروتوكول نموذج لدراسة التئام الجروح في بيئة ثلاثية الأبعاد طبقية طبيعية. استخدام جهاز الثقافة كوسيط بين الخلية والثقافة والدراسات المجراة في يقلل كثيرا من التكاليف، فضلا عن الحد من الإجراءات المتعلقة بالحيوانات الحية. 3D نماذج أخرى قد تم فائدة كبيرة في الميدان بما في ذلك ذاتية توليف الكولاجين المواد الهلامية مصنوعة من الابتدائي الليفية القرنية البشرية2 أو هذه الخلايا نفسها جزءا لا يتجزأ من المواد الهلامية مصنوعة من collagens المستمدة من الحيوانات31. النظام النموذ...

تندب في القرنية الناتجة عن الإصابة أو الصدمة أو الإصابة يمكن أن تؤدي إلى إضعاف نسبة تظليل وفقدان الرؤية الدائمة. ومن ثم، هناك حاجة ماسة لتحديد المسارات التي يمكن أن تكون مستهدفة للتدخل العلاجي. خيارات العلاج الحالية محدودة، وتتمثل أساسا في عمليات زرع القرنية، التي لا يمكن الوصول إلى المرضى عبر العالم. الإنسان (الشكل 1) والقرنية الحيوانية يمكن أن تستخدم ل 2D وخلية 3D ثقافة الدراسات1،2. يمكن الحصول على القرنيات الجثث البشرية لا تصلح لزرع من المصارف العين أو مصارف مركزية الأنسجة (الوطنية المرض بحوث التبادل (ندري))، ويمكن الحصول على عيون الحيوان من مسلخ. الابتدائي الخلايا الظهارية القرنية والليفية stromal وأكثر في الآونة الأخيرة، خلايا بطانية، يمكن عزل ومثقف من هذه الأنسجة لالتئام الجروح ودراسات علم السموم3،،من45. بالإضافة إلى أهمية فهم الأساس الجزيئي لأمراض العيون المسببة للعمى، جعلت إمكانية الحصول على القدرة على الثقافة الابتدائية الخلايا والأنسجة القرنية نظام نموذجا هاما للدراسة. القرنية مثالية لاختبار آثار وكلاء على تندب القرنية عادية تتسم بالشفافية وإنشاء أنواع معينة من الجروح نسبة تظليل أو ندبات تليفية (استعرض في6). في فيفو القرنية الجرح الشفاء نماذج عديدة أيضا على نطاق واسع استخدمت تندب الدراسات1. وقد استخدمت أقل السابقين فيفو القرنية الجرح الشفاء النموذجي7،8 هي تصف بالتفصيل هنا. والهدف من هذا الأسلوب لقياس نتائج تندب تتميز بصانعي تليفية في 3D متعددة الخلايا القرنية السابقين فيفو نموذج النظام.
إصابة الظهارة القرنية التي لا يخل الغشاء الظهارية عادة يغلق داخل 24-72 ح9. قريبا بعد إصابة، تبدأ الخلايا عند حافة ظهارة تنتشر وتهاجر إلى السطح الحر الظهارية، وإعادة تأسيس وظيفة الحاجز الظهارية. هذا النشاط تسلسلياً يليه تفعيل انتشار الخلايا القاعدية القرنية أولاً، وفي مرحلة لاحقة، من الخلايا السليفة التي تقع في منطقة حوفي الخارجي لتحقيق الانتعاش من الخلايا الظهارية الشامل10،11. غالباً ما تشفي هذه الجروح بدون تندب. ومع ذلك، النتائج جرح التي تخترق الغشاء الطابق السفلي ستروما غالباً ما في تشكيل ندبة1. بعد إصابة stromal القرنية، يتم ملؤها سدى مع خلايا أصول متعددة بما في ذلك الخلايا اللحمية المقيم المتباينة، فضلا عن المشتقة من نخاع العظم فيبروسيتيس12،،من1314. ندبات تليفية تتسم باستمرار ميوفيبروبلاستس في التئام الجروح. إظهار هذه ميوفيبروبلاستس المرضية الالتصاق المتزايد من خلال تراكم إينتيجرينس في الالتصاقات المحورية، وألياف الإجهاد أكتين (α-SMA) الهوس α-السلس العضلات والتنشيط المحلي للمصفوفة خارج الخلية (ECM)-المحتبسة الكامنة تحويل عامل النمو-بيتا (TGFβ). التفريق بين الخلايا الظهارية المشتقة، تعرف باسم الظهارية الانتقالية الوسيطة (EMT)، قد يسهم أيضا في ندبة تشكيل6.
هناك توازن دقيق بين الخلية التمايز والمبرمج بعد إصابة. بسبب الخرق في غشاء الطابق السفلي، عوامل النمو مثل عامل النمو المشتقة من الصفيحات (PDGF) و TGFβ من الدموع وظهاره يستحم ستروما، الذي يحفز التمايز أرومية، حلقة متواصلة autocrine TGFβ التنشيط، إفراز غير منظم تليفية ECM15،16. ويعزز استمرار ميوفيبروبلاستس في الجرح تلتئم الضباب والندوب في القرنية (الشكل 2). ومع ذلك، في ريجينيراتيفيلي تلتئم الجرح على الرغم من أن تطوير ميوفيبروبلاستس، أنهم أبوبتوسي وهكذا هي غائبة أو انخفاض ملحوظ في عدد في الأنسجة تلتئم في المرجع6،10(استعراض). وهكذا، قد ركزت البحوث على ندبات تليفية جزئيا على الأقل على استهداف الجزيئات التي تحول دون التنمية أرومية المفرط أو أرومية استمرار17،18. نظراً لاستمرار أرومية يميز المرض ندبات وتليفيه على حد سواء في جميع الأنسجة19، قد يكون من المفيد كنظام نموذجي لدراسة الآليات الخلوية العامة التليف القرنية.
في النظام النموذجي، هو إصابة القرنية بشفرة أسطواني يسمى ترفين في حين لا يزال في أنحاء العالم. البشرية ويمكن إصابة الخنازير القرنيات مع أما 6 أو 7 ملم تريفيني؛ للقرنيات الأرنب ترفين 6 مم المفضل. القرنية الخنزير مشابه في الحجم للقرنية البشرية. لأنها فعالة من حيث التكلفة ومتاحة بسهولة في إعداد كبيرة، والقرنيات خنزير تستخدم بشكل روتيني لثقافة الجهاز. وعلاوة على ذلك، قد دأبت كروسريكتيد الأجسام المضادة وسيرناس لتتفاعل مع الإنسان مع خنزير7. بعد إصابة، القرنيات هي قطع من أنحاء العالم مع ليمبوس سليمة والتي شنت على قاعدة أجار/الكولاجين. القرنيات تربى في وسائل الإعلام الحرة المصل بالإضافة إلى استقرت فيتامين (ج) لمحاكاة انتشار تنتجها الخلايا الليفية وإدارة المحتوى في المؤسسة ترسب20. إضافة المصل لا عوامل النمو لا بد للحث على تشكيل أرومية7. القرنيات بشكل روتيني ثابت وتجهيزها للأنسجة بعد أسبوعين ثقافة. للجينات ضربة قاضية، أو لاختبار آثار وكيلاً على التئام الجرح يمكن أن تعامل مع siRNA في الجرح بعد إصابة7 أو عامل القابلة لذوبان يمكن أن تضاف إلى وسائل الإعلام، على التوالي8.

<table><tbody><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>10-010-023</td><td></td></tr><tr><td>Pen Strep&nbsp;</td><td>MP Biomedicals</td><td>91670049</td><td></td></tr> محلول <tr><td>الكولاجين البقري</td><td>Advance Biomatrix</td><td>5005</td><td></td></tr><tr><td>عيون خنزير مع جفون متصلة &nbsp;</td><td>بيل فريز ، أركنساس</td><td>N / A</td><td></td></tr><tr><td>6.0 مم تريفين &nbsp ؛</td><td>Katena</td><td>K28014</td><td></td></tr><tr><td>شفرة جراحية&nbsp;</td><td>Personna</td><td>0.009</td><td></td></tr><tr><td>مقص صغير</td><td>فيشر</td><td>895110</td><td></td></tr><tr><td>ملقط</td><td>فيشر</td><td>08953-F</td><td></td></tr><tr><td>مناديل كيم المبللة &nbsp ؛</td><td>Kimberly-Clark&trade; 34120</td><td>06-666</td><td></td></tr><tr><td>أطباق زراعة الخلايا 60 مم&nbsp;</td><td>فالكون</td><td>08-772B</td><td></td></tr><tr><td><قوي> المكملات المكملة خالية من المصل (SSFM)</td><td></td><td></td><td>أضف جميع المكونات التالية إلى DMEM/F-12:&nbsp; ITS ، RPMI ، الجلوتاثيون ، L-Glutamine ، الأحماض الأمينية غير الأساسية MEM ، بيروفات الصوديوم MEM ، ABAM ، الجنتاميسين ، فيتامين C. & nbsp ؛ </td></tr><tr><td>DMEM / F-12</td><td>Gibco</td><td>11330</td><td></td></tr><tr><td>ITS ملحق الوسائط السائلة &nbsp ؛</td><td>Sigma</td><td>I3146</td><td>100X</td></tr><tr><td>RPMI 1640 محلول الفيتامينات&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>R7256</td><td>100x</td></tr><tr><td>Glutathione</td><td>Sigma</td><td>G6013</td><td>استخدم في 1 & micro ؛ جم / مل. تجميد الحصص ؛ لا تعيد استخدامها بعد الذوبان.</td></tr><tr><td>1٪ محلول L-glutamine &nbsp ؛</td><td>Gibco</td><td>25030-081</td><td>100x</td></tr><tr><td>MEM محلول الأحماض الأمينية غير الأساسية &nbsp;</td><td>Gibco</td><td>11140</td><td>100x</td></tr><tr><td>MEM محلول بيروفات الصوديوم &nbsp;</td><td>Gibco</td><td>11360</td><td>1 M Stocks (1,000x) والتجميد في aliquits للاستخدام الواحد.&nbsp; استخدمه من الفريزر في كل مرة يتم فيها عمل الوسائط.</td></tr><tr><td>ABAM&nbsp;</td><td>سيجما</td><td>A7292</td><td>100x</td></tr><tr><td>Gentamicin&nbsp;</td><td>سيجما</td><td>30-005-CR</td><td>200x</td></tr><tr><td>فيتامين C & nbsp ؛</td><td>واكو</td><td>070-0483</td><td>2-0-aD حمض الجلوكوبيرانوسيل-الأسكوربيك. 1 ملي مخزون (1000x)</td></tr> <tr><td>10٪ يود &nbsp ؛</td><td>فيشر كيماويكال</td><td>SI86-1</td><td></td></tr><tr><td>كاسيت مسار الأنسجة &nbsp;</td><td>فيشر</td><td>22-272416</td><td></td></tr><tr><td>مصل الماعز العادي (NGS)</td><td>Jackson Immuno Research</td><td>005-000-121</td><td>نستخدم وسائط تركيب NGS 3</td></tr><tr><td>٪ &nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>TA-030-FM</td><td></td></tr><tr><td>آمن كلير&nbsp;</td><td>فيشر</td><td>314-629</td><td></td></tr><tr><td>كحول إيثيلي</td><td>فائق نقاء</td><td>200CSGP</td><td>200 برهان ، مخفف بنسبة 100٪ ، 70٪ ، 50٪) &nbsp ؛</td></tr><tr><td>سترات الصوديوم&nbsp;</td><td>فيشر</td><td>BP327</td><td>10 ملي متر ، درجة الحموضة 6.4</td></tr><tr><td>هيماتوكسيلين</td><td>EMD ميليبور</td><td>M10742500</td><td></td></tr><tr><td>عامل زرق&nbsp;</td><td>شركة ريكا للكيماويات</td><td>220-106</td><td></td></tr><tr><td>1٪ Triton X-100</td><td>Fisher</td><td>9002-93-1</td><td>مخفف في PBS</td></tr><tr><td>0.1٪ Tween 20 &nbsp ؛</td><td>فيشر</td><td>BP337</td><td>مخفف في PBS</td></tr><tr><td>3٪ بيروكسيد الهيدروجين &nbsp ؛</td><td>فيشر</td><td>H324</td><td></td></tr><tr><td>DAB كيت&nbsp;</td><td>مختبرات ناقلات</td><td>SK-4100</td><td></td></tr><tr><td>Agar&nbsp;</td><td>فيشر&nbsp;</td><td>BP1423-500</td><td>محلول أجار: قم بإعداد 1٪ أجار و 1 مجم / مل من الكولاجين البقري في DMEM-F12 حتى 20 مل</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Bermis</td><td>13-374-12</td><td></td></tr><tr><td>Moist</td><td></td><td></td> Chamber <td>استخدم أي حجرة ، وقم بتغطيتها بمنديل مبلل ثم ضع طبقة من Parafilm فوقها.</td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Qiagen RNAprotect كاشف الخلية</td><td>Qiagen</td> <td>&nbsp ؛ 76104</td><td></td></tr><tr><td>Ambion PureLink RNA Mini Kit</td><td>Thermo Scientific</td><td>12183018A</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Fibronectin-EDA Antibody</td><td>Sigma</td><td>F6140</td><td>1:200 مخفف في&nbsp; 3٪ مصل ماعز عادي</td></tr><tr><td>مضاد للعضلات الملساء ألفا الأكتين الأجسام المضادة</td><td>Sigma</td><td>A2547 أو C6198 (cy3 مترافقة)</td> <td>1:200 مخفف في مصل الماعز العادي 3٪</td></tr><tr><td>Permafluor &nbsp;</td><td>ثرمو ساينتيك</td><td>TA-030-FM</td><td></td></tr><tr><td>DAPI&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>P36931</td><td></td></tr><tr><td>Gt الأجسام المضادة الثانوية المضادة ل -MS IgG (H + L) ، HRP & nbsp ؛</td><td>Invitrogen</td><td>62-6520</td><td>1: 100 مخفف في مصل الماعز العادي 3٪ (ل a-SMA ، تلطيخ DAB)</td></tr> <tr><td>Gt المضاد المضاد ل -MS IgM (H + L) الجسم المضاد الثانوي ، HRP & nbsp ؛</td><td>Thermo Scientific</td><td>PA1-85999</td><td>1: 100 مخفف في مصل الماعز العادي بنسبة 3٪ (ل FN-EDA ، DAB تلطيخ)</td></tr> <tr><td>Gt المضاد المضاد الثانوي ل -MS IgG (H + L) ، Cy3 & nbsp ؛</td><td>Jackson Immuno Research</td><td>115-165-146</td><td>1:200 مخفف في&nbsp; 3٪ مصل الماعز العادي (ل a-SMA ، تلطيخ الفلورة)</td></tr> <tr><td>&nbsp; Zeiss Axioplan2&nbsp;</td>أدوات تشخيص <td>Zeiss</td><td></td><td>Microscope</td></tr><tr><td>SPOT-2</td><td>، Sterling Heights ،</td> كاميرا <td></td><td>Michigan CCD</td></tr></tbody></table>

السابقين فيفو الجهاز القرنية الثقافة النموذجية لالتئام الدراسات

Ex Vivo Corneal Organ Culture Model for Wound Healing Studies

القرنية وقد استخدمت على نطاق واسع كنظام نموذجي لدراسة التئام الجروح. القدرة على توليد واستخدام خلايا الثدييات الأولية في اثنين الأبعاد (2D) والثقافة (ثلاثي الأبعاد) الأبعاد الثلاثة قد ولدت ثروة معلومات ليس فقط حول البيولوجيا القرنية ولكن أيضا حول الجرح تضميد الجراح، والبيولوجيا أرومية، وتندب بشكل عام . وهدف البروتوكول هو نظام مقايسة للتحديد الكمي للتنمية أرومية، الذي يميز تندب. علينا أن نظهر ثقافة جهاز القرنية السابقين فيفو نموذج باستخدام عيون خنزير. في هذا كيراتيكتومي الأمامي الجرح، جرح القرنيات لا يزال في أنحاء العالم مع شفرة دائرية تسمى ترفين. يتم إزالة المكونات من حوالي 1/3 للقرنية الأمامي منها الظهارة والغشاء الطابق السفلي والجزء الأمامي ستروما. بعد إصابة، هي القرنيات قص من أنحاء العالم والتي شنت على قاعدة الكولاجين/أجار ومثقف لمدة أسبوعين في المصل تستكمل المتوسطة الحرة مع استقرار فيتامين C لزيادة تكاثر الخلايا وإفراز المصفوفة خارج الخلية من الخلايا الليفية المقيم. تفعيل ميوفيبروبلاستس في ستروما الأمامي يتجلى في القرنية تلتئم. يمكن استخدام هذا النموذج للاعتداء إغلاق الجرح، وضع علامات تليفية وميوفيبروبلاستس، ودراسات علم السموم. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن اختبار تأثيرات مثبطات جزيء صغير، فضلا عن تعداء siRNA الدهن بوساطة للجينات ضربة قاضية في هذا النظام.

إيمونوهيستوتشيميستري هو الفحص الأولية المستخدمة لتحليل نجاح السابقين فيفو الجرح تجربة الشفاء. ويصور الشكل 4 ظهارة وسدى الأمامي في الأنسجة التحكم (الشكل 4A, 4B). ست ساعات بعد إصابة، الظهارة كان غائبا (الشكل 4، 4 د). ستة أيام بعد إصابة كما هو متوقع، قد ريجروون الظهارة (الرقم 4E، 4F). وكان هذا النسيج إيمونوستينيد للعضلات ال...

بروتوكول للسابقين فيفو الجهاز القرنية الثقافة النموذجية مفيدة للجرح شفاء الدراسات هو وصف. يمكن استخدام هذا النظام النموذجي لتقييم آثار عوامل لتعزيز الشفاء التجدد أو سمية العقاقير في بيئة متعددة الخلايا 3D منظم.

The cornea has been used extensively as a model system to study wound healing. The ability to generate and utilize primary mammalian cells in two ...

وصفت هذه الورقة طريقة بسيطة لجرد الجرح في نظام نموذج ثقافة الجهاز متعدد الأبعاد والخلوية ثلاثي الأبعاد. نحن نفعل ذلك باستخدام عيون الخنزير، ولكن حتى لو كنت غير مألوفة مع العينين، يمكنك القيام بذلك الفحص. كنظرة عامة، تلقينا عيون porcine، وقطع الكرة الأرضية، وجعل الجرح الدائري في القرنية التي تمر عبر ظهارة وحوالي ثلث ستروما.نقطع القرنية، ونثبتها على قاعدة أجار، ونضع هذا البناء في الحاضنة. الأنسجة سوف تملأ في خلق ندبة في القرنية. لا تحتاج إلى إضافة أي عوامل النمو، أو حتى المصل.ويتم ذلك في وسائل الإعلام خالية من المصل. على الرغم من أن يتم تنفيذ هذا في القرنية، ويمكن استخدامه كنظام نموذجي للشفاء الليفي بشكل عام. كما العديد من المسارات الخلوية التي يتم تنشيطها أثناء تندب متشابهة بين النظم.في غطاء غطاء محرك السيارة للسلامة البيولوجية، استخدم شفرة جراحية على حافة مستقيمة لإزالة الكرة الأرضية من الغطاء على لوحة تقطيع تنظيف الإيثانول، وإزالة الأنسجة الدهنية الزائدة من كل عين. عقد العالم تنظيفها في وقت ما بعد مع ملقط تراجع على الفور العين في برنامج تلفزيوني تليها ثلاثة انخفاضات سريعة في 10٪ اليود، واثنين من الانخفاضات السريعة في برنامج تلفزيوني. ثم لف العين محيطاً مع أنسجة مختبر نظيفة لتلتف مع ما يكفي من الضغط لتحقيق سطح القرنية مشدود دون الاتصال القرنية.باستخدام التربهينات الستة ملليمترات، تخترق الظهارة في الستروما الأمامية في وسط القرنية دون إجراء جرح كامل السمك من خلال القرنية بأكملها، وتدوير الترفين 180 درجة في اتجاه عقارب الساعة ومضادة عقارب الساعة خمس مرات مع تطبيق ضغط الضوء لتعميق الجرح. عندما يكون الجرح عميقًا بما يكفي للسماح برفع رفرف الأنسجة بالملقط ، استخدم شفرة جراحية لقطع رفرف موازٍ للعالم مع الاستمرار في رفع القرنية الأمامية ضمن هامش الجرح. عندما تتم إزالة رفرف كامل، يجب أن يكون موجودا الجرح الدائري في وسط القرنية.لحصاد القرنية فهم العين مع أنسجة المختبر، واستخدام شفرة الجراحية لجعل شق صغير ملليمتر واحد بعيدا عن حافة القرنية لتشمل جمع limbus والأنسجة. باستخدام مقص صغير، حاد مواصلة شق في جميع أنحاء العالم حفظ هامش ملليمتر عبر القرنية للحفاظ على limbus في لباقة. ثم ضع القرنية، جانب الجرح إلى أسفل، في طبق 60 ملليمتر، أو 100 ملليمتر يحتوي على ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني.لتركيب القرنية، استخدم زوجين من ملقط لعقد القرنية الظهارية الجانب حتى لخلق كوب، واستخدام ماصة نقل العقيمة لإضافة محلول أجار دافئ في القرنية حتى الكأس الكامل. بعد تصلب أجار، ضع القرنية بعناية في لوحة جديدة من 60 ملليمترًا على الجانب الأسفل وقم بتغطية الطبق بغطاء. ثم تضاف أربعة ملليلترات من المتوسط الخالي من المصل التكميلي إلى كل صفيحة من القرنيات التي تحافظ على القرنيات عند واجهة هوائية سائلة على الحدود الطرفية في حاضنة لثقافة الخلايا عند 37 درجة مئوية في 5٪ من ثاني أكسيد الكربون، وتبلل الأسطح القرنية مرة واحدة يومياً مع قطرة واحدة من المتوسطة الخالية من المصل التكميلية من المتوسط المكيف في الطبق للحفاظ على رطوبة الأنسجة.بالنسبة للجينات النازلة ، اخلط خمسة ميكرولترات من التداخل الصغير أو siRNa مع 50 ميكرولترات من الحد الأدنى من المتوسط الأساسي في المصل واثنين من microliters من كاشف transfection. مع 50 ميكرولترات من متوسطة المصل المخفضة لكل قرنية. بعد خمس دقائق، اخلطي خليطين معًا، وأضيفي 200 ميكرولترات من الحد الأدنى لمصل المصل المتوسط لكل خليط من الـ سيرنا.ثم الماصات حلول سيرنا إسقاط الحكمة على كل جرح. ثم ضع القرنيات في الحاضنة. بعد ثلاث ساعات، استخدم المتوسط في كل طبق لغسل الـ سيرنا من أسطح القرنية، واستبدل الوسط المكيف في كل طبق بمصل جديد مجاني بالإضافة إلى المضادات الحيوية.ثم إعادة الثقافات القرنية إلى حاضنة ثقافة الخلية، واحتضان لمدة أسبوعين. بعد ست ساعات من الإصابة ، ظهارة القرنية غائبة. بعد ستة أيام من الإصابة، ظهارة تنمو.الفلوريسنس الأمينية تلطيخ مع ألفا العضلات الملساء actin يكشف عن تدرج من myofibrobroblasts النشطة على طول هامش الجرح من الأمامي إلى ستروما الخلفي. مناعية هيستوكيميائية تلطيخ ألفا العضلات الملساء actin يكشف عن زيادة كبيرة في ألفا العضلات الملساء actin بروتين التعبير في الجرحى بالإضافة إلى التحكم القرنيات سيرنا. بالمقارنة مع البروتين غير المُجَوَّل والهادف الذي عالجته الـ(سيرنا) القرنية المجروحة.وبالمثل، يتم رفع النطاق الإضافي في الليفية A في القرنيات المعالجة في سيرنا مقارنة بالبروتين غير المُجَوَّل والهادف الذي عالجته سيرنا القرنيات المجروحة. إظهار نجاح هدم البروتين المستهدف. وعلاوة على ذلك، علاج القرنيات الجرحى مع السم الذي يستهدف بشكل غير محدد البروتين الهدف يمنع إعادة الظهارة ويؤدي إلى موت الخلايا النوعية، ومصفوفة غير منظمة، وvacuoles stromal مما يشير إلى أن السم لا يشجع الشفاء في تركيز مقايسة.في الختام، في حين تحاول هذا الإجراء من المهم أن نتذكر أن تبقي شفرة موازية للأنسجة في حين قطع، بحيث لا تخترق الكرة الأرضية. ويمكن استخدام تقنيات مختلفة جرح مع هذا الفحص، بما في ذلك حرق الكيميائية أو كشط الظهارية. ويمكن أيضا أن تستخدم لمقايس سمية المخدرات لتحديد ما إذا كان ظهارة يشفي وعلى أي معدل.هذا هو التوفير في التكاليف السابقين vivo، الجهاز نظام نموذج ثقافة التي يمكن أن تسبق الخاص بك في دراسات الشفاء الجروح الجسم الحي.

ex-vivo-corneal-organ-culture-model-for-wound-healing-studies

Research

JoVE Journal

Medicine

الطب

نفيدكم تقنية لتصنيع micropockets داخل الأغشية electrospun للدراسة سلوك الخلية. على وجه التحديد، ونحن تصف مزيج من microstereolithography وelectrospinning لإنتاج PLGA (بولي (lactide-CO-glycolide)) أجهزة بيولوجية القرنية مجهزة microfeatures.

مزيج من Microstereolithography وElectrospinning لإنتاج أغشية مجهزة الكوات لتجديد القرنية

الموصوف هنا هو إنشاء نموذج جراحة إعتام عدسة العين الوهمي ذي الصلة سريريا خارج الجسم الحي والذي يمكن استخدامه للتحقيق في آليات استجابة إصابة الأنسجة الظهارية داخل بيئتها المكروية الأصلية.

إنشاء ذات الصلة سريريا<em&gt; السابقين فيفو</em&gt; موك الساد نموذج جراحة للتحقيق الظهارية إصلاح الجرح في المكروية الأم

هذا البروتوكول وصف أسلوب لتلحق التآكل على سطح العين للماوس، ومتابعة الجرح شفاء العملية بعد ذلك. البروتوكول يستفيد من لدغ العين جزئيا إزالة ظهارة سطح العين في الفئران فظاعتها.

سحجه الظهارة القرنية مع لدغ العين كنموذج للقرنية التئام الجروح

هنا ، يتم تقديم بروتوكول خطوه بخطوه لاعداد وزراعه الخنازير الانقسام أزرار القرنية. كما يظهر هذا النموذج العضوي المزروع عاده معدلات وفيات الخلايا في غضون 15 يوما ، مقارنه بالقرنيات المتبرعة البشرية ، فانه يمثل النموذج الأول الذي يسمح للزراعة طويلة الأجل من القرنيات غير البشرية دون أضافه السامة ديكسان.

نموذج ثقافة الجهاز البطانية القرنية الخنازير باستخدام أزرار القرنية الانقسام

هنا، نقدم بروتوكولا لفصل الخلايا الانفية القرنية (CEC) من غشاء Descemet (DM) باستخدام النيوديميوم: YAG (Nd:YAG) ليزر كنموذج مرض الجسم الحي السابق لاعتلال القرنية المغرور (BK).

تطوير نموذج تجريبي غير باضع بمساعدة الليزر لفقدان الخلايا الانهوفية القرنية

توضح هذه المقالة بروتوكول خطوة بخطوة لإعداد نموذج مُنَقَر vivo السابقين من التهاب القرنية البكتيري. يستخدم Pseudomonas aeruginosa ككائن اضروبي. هذا النموذج المبتكر يحاكي في العدوى الجسمية كما تكاثر البكتيريا يعتمد على قدرة البكتيريا على تلف أنسجة القرنية.

إنشاء نموذج بورسين السابقين فيفو القرنية لدراسة العلاجات الدوائية ضد التهاب القرنية البكتيرية

هنا ، يتم وصف بروتوكول لإنشاء جرح تآكل ظهاري مركزي للقرنية في الفأر باستخدام تريفين وسبود نادي غولف حاد. نموذج التئام جروح القرنية هذا قابل للتكرار بشكل كبير ويتم استخدامه الآن لتقييم التئام جروح القرنية المعرضة للخطر في سياق الأمراض.

نموذج التآكل الظهاري لدراسة التئام جروح القرنية

هنا ، يتم تطوير نماذج حيوانية تعتمد على الفئران والأرانب للإصابات الميكانيكية والكيميائية لظهارة القرنية لفحص العلاجات الجديدة والآلية الأساسية.

نماذج الحيوانات خارج الجسم الحي وفي الجسم الحي للإصابات الميكانيكية والكيميائية لظهارة القرنية

تجريد Descemet's Stripping Only هو إجراء تجريبي حيث يقوم المرضى الذين يعانون من الأمعاء القرنية المركزية الناتجة عن حثل القرنية البطانية Fuchs بتجريد غشاء Descemet للخلايا الطرفية لتجديد الطبقة البطانية. نقدم منهجية جديدة تحاكي DSO في القرنيات البشرية الضمور خارج الجسم الحي مع الشفاء المتسارع الذي يحفزه eFGF1 (NM141).

نموذج لزراعة أعضاء القرنية البشرية لتجريد Descemet فقط مع الشفاء المتسارع الذي يحفزه عامل نمو الخلايا الليفية المصمم هندسيا 1

يوضح هذا البروتوكول الخطوات المختلفة التي ينطوي عليها جرح قرنية كتكوت جنيني في البيض. يمكن تحليل القرنيات المجددة أو المستعادة بالكامل بحثا عن إمكانات التجدد باستخدام تقنيات خلوية وجزيئية مختلفة بعد إجراء الجرح.

التحقيق في تجديد الأنسجة الخالية من الندوب في قرنية الفرخ الجنينية المصابة

توفر زراعة أعضاء قرنية الخنازير خارج الجسم الحي والتئام الجروح الظهارية وسيلة اقتصادية وأخلاقية وقابلة للتكرار وكمية لاختبار سمية العين للمواد الكيميائية. كما أنها تساعد في توضيح الآليات الكامنة وراء تنظيم الظهارة وإصلاح الأنسجة ، وفي تقييم العلاجات لعلاج اعتلال القرنية السكري وتأخر التئام الجروح.

تقييم السمية العلاجية والكيميائية باستخدام قرنيات الخنازير المستزرعة بالأعضاء والتئام الجروح الظهارية

تعلم نموذج زراعة الأعضاء القرنية خارج الجسم الحي لدراسة التئام الجروح باستخدام عيون الخنازير. يتيح هذا النموذج تقييم تأثيرات العوامل المختلفة على الشفاء التجددي والسمية الدوائية في بيئة ثلاثية الأبعاد.

السابقين فيفو الجهاز القرنية الثقافة النموذجية لالتئام الدراسات

استكشف المزيد من الفيديوهات