استخدام القناصة-Cas9 إلى أدنى حد من آثار خارج الهدف كريسبر-Cas9 دون فقدان النشاط على الهدف عن طريق التطور الموجه

في الطبيعة ، Cas9 هو بروتين مناعي ضد الفيروسات الغازية التي تفضل تطور Cas9 مع خصوصية منحرفة التي يمكن أن تتشابك الحمض النووي الفيروسي مع الطفرات العفوية. لقد بنينا نظام تطور موجه اصطناعي يفضل متغير Cas9 الأمثل مع خصوصية عالية. تعمل كل من الاختيارات السلبية والإيجابية في وقت واحد في نظام فحص القناصة.

يمكن فحص المتغيرات Cas9 مع انخفاض النشاط خارج الهدف أيضًا الحفاظ على النشاط على الهدف في وقت واحد. تم إدخال الطفرات على تسلسل Cas9 بأكمله بشكل عشوائي لإنتاج المكتبة ليتم فحصها. وهذا جعل من الممكن العثور على الطفرات في مواقف غير متوقعة.

حاليا، العديد من الباحثين في الأوساط الأكاديمية والصناعة يستخدمون Y-نوع Cas9 للتطورات العلاجية. ومع ذلك، لا يتم تحسين خصوصية Y-type Cas9، مما قد يؤدي إلى إيقاف معبأة بإحكام. في البشر ، وهذا يعني طفرات غير متوقعة في الجينات العشوائية ، والتي يمكن أن تؤدي إلى آثار جانبية خطيرة.

هناك العديد من Cas9 مثل الإنزيمات التي يجري تطويرها في العلاجات. ويمكن استخدام أسلوبنا لتحسين خصوصية الحمض النووي والنويات الأخرى مثل جيبينغر، تايلاند، وكاس 9 أيضا مثل CPF1. جعل مكتبة كبيرة بما فيه الكفاية هو المفتاح لزيادة إمكانيات الحصول على متغير مع وظيفة هامة.

تأكد من الحصول على كفاءة عالية في خطوة التبريد، واستخدام خلايا ذات كفاءة عالية المختصة. لبدء هذا الإجراء، إضافة نانوغرام واحد من كل من بلازميد CCDB وSGRNA plasmid مع عدم التطابق المزدوج إلى خمسين ميكرولترات من الخلايا الملوثة BW25141 GOI. خلط الخلايا بلطف عن طريق الأنابيب، ونقلها إلى ما قبل مبردة، 0.1 سنتيمتر الكهربائية cuvette.

تحويل الإشريكية القولونية مع اثنين من plasmids عن طريق الكهرباء. مباشرة بعد الانتهاء من electroporation، إضافة 250 ميكرولترات من وسط SOC. الماصات بلطف الحل لخلط الخلايا والمتوسطة، ونقل الخليط إلى أنبوب microcentrifuge 1.5 ملليلتر.

استعادة الخلايا المحولة واحتضانها في 32 درجة مئوية، مع اهتزاز لطيف لمدة ساعة واحدة. متابعة إعداد خلايا فحص Snyper كما هو موضح في بروتوكول النص. عندما تكون على استعداد لأداء فحص سنايدر، وتحويل خلايا الفحص سنايدر مع 100 نانوغرام من البلازميدات Cas9 البديلة المعدة من كل مكتبة باستخدام عملية إلكتروسوريشن التي وصفت سابقا.

ثم, نقل 250 ميكرولترات من الخلايا إلى أنبوب 1.5 ملليلتر microcentuge الطازجة. أضف 250 بيكوغرام من ATC إلى تركيز نهائي من 10 نانوغرام لكل ملليلتر. استرداد كل من الخلايا التي تحتوي على ATC وخالية من ATC عن طريق احتضانها في 32 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة مع اهتزاز لطيف.

لوحة 25 ميكرولترات من الخلايا الخالية من ATC تعافى على لوحة LB أجار, تحتوي على الكلورامفينيكول وkanamycin. أضف ATC إلى ATC المستردة التي تحتوي على الخلايا إلى تركيز النهائي من 100 نانوغرام لكل ملليلتر على 245 ملليمتر LB agar لوحة. على الفور لوحة الخلايا التي تحتوي على ATC على agar LB تحتوي على لوحة تحتوي على الكلورامفينيكول، كاناميسين، وعربينوز.

احتضان جميع لوحات بين عشية وضحاها في 32 درجة مئوية. في اليوم التالي، صور اللوحات. باستخدام برنامج CFU المفتوح ، عد عدد المستعمرات القابلة للحياة ، والتأكد من أن عدد المستعمرات على الصفيحة غير الانتقائية أكبر بعشر مرات على الأقل من تنوع المكتبة ، لتغطية جميع المتغيرات.

سحب المستعمرات التي نجت على لوحات انتقائية من جميع المكتبات الثلاث. نقل هذه المستعمرات المجمعة إلى 250 ملليلتر من متوسطة LB، تكملها الكلورامفينيكول، واحتضان بين عشية وضحاها في 42 درجة مئوية. أولاً، قم بتحميل برنامج Cas OF Finder لاختيار المواقع المستهدفة.

حدد نوع PAM المناسب لنوع معين من Cas9 و الجينوم الهدف. تعبئة في علامة التبويب تسلسلات الاستعلام. اختر رقم عدم التطابق وانقر على زر الإرسال.

بعد بضع ثوان، سوف تظهر المواقع على الهدف وخارجها. بشكل عام، اختر المواقع خارج الهدف مع عدم التطابق واحد إلى ثلاثة. المقبل ، والنظام في رنا وRRNA oligos المسار مع تسلسل قالب وتضخيم القالب كما هو مبين في بروتوكول النص.

تحليل اثنين من microliters من الحمض النووي قالب تضخيم، على هلام agarose 2٪ومن ثم تنقية القالب. احتضان خليط التفاعل بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية. في اليوم التالي، إضافة 0.5 ميكرولترات من DNAse واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة 15 إلى 30 دقيقة، ومن ثم تنقية SGRNA.

ثم، علاج 10 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي في المختبر منقولة مع 250 وحدة من الفوشطة النخاعية القلوية لمدة ثلاث ساعات في 3 درجات مئوية، في وجود 100 وحدة من مثبطات RNAse، ومن ثم تنقية SGRNA المعالجة. أولا، الحفاظ على خلايا HEK293 T في DMEM تكمل مع 10٪ FBS و 1٪ المضادات الحيوية في 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون. المقبل، مزيج اثنين من ميكروغرام من نوع البرية أو بروتين Snyper Cas9 مع اثنين من ميكروغرام من SGRNA، واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة عشر دقائق لجعل مجمعات RNP.

تبسينيزي عد الخلايا، ثم غسلها وإعدادها في المخزن المؤقت الكهربائي كما هو مبين في بروتوكول النص. الكهربائي مجمعات RNP في الخلايا باستخدام نبضة واحدة من 1300 فولت لمدة 30 مللي ثانية. مباشرة بعد electroporation، لوحة الخلايا على لوحة 48-جيدا مليئة 500 ميكرولترات من DMEM، تستكمل مع 10٪ FBS و 1٪ المضادات الحيوية.

احتضان في 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون. الحفاظ على خلايا HEK293 T في DMEM تكملها 10٪ FBS و 1٪ المضادات الحيوية في 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون. في اليوم السابق لتحول، تبسينيزي و عد الخلايا.

إذا كان يعمل على نطاق 48 جيدا، لوحة 10، 000 خلية في البئر و 250 ميكرولترات من متوسط النمو الكامل. باستخدام كاشف transfection القائم على الدهون، وإعداد 250 نانوغرام من P3S Cas9 plasmid و 250 نانوغرام من SGRNA لTransfection. ثم، مزيج البلازميدات في 25 ميكرولترات من ميوم خالية من المصل.

تمييع ميكرولتر واحد من كاشف transfection مع 25 ميكرولترات من MEM خالية من المصل. احتضان هذا الخليط في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. الجمع بين خليط البلازميد مع خليط مُكشف نقل الحيوانات واحتضانه في الغرفة لمدة 20 دقيقة لتشكيل مجمعات بليسميد ليبوفكتامين.

بعد ذلك، إضافة 50 ميكرولترات من هذا الخليط مباشرة إلى كل خلايا تحتوي على البئر. صخرة بلطف لوحة ذهابا وإيابا لخلط. احتضان الخلايا في 37 درجة مئوية في حاضنة ثاني أكسيد الكربون لمدة 48 إلى 72 ساعة بعد transfection، قبل أن يُحسب للتعبير الجينية العابرة.

بعد عزل الحمض النووي الجينومي المعد سابقاً، قم بتوليد مكتبات تسلسلية عميقة عن طريق تضخيم نظام PCR لـ GDNA مع الجاهمات الأولية التي تستهدف الهدف وخارج الهدف. ثم استخدم التمهيدي الفهرس لتسمية كل عينة. استخدم جهاز تسلسل الجيل التالي لإخضاع مكتبات التجمع لتسلسل نهاية مقترن.

بعد أن يتم تنفيذ شاشة Snyper، يمكن حساب النسبة المئوية للمستعمرات البقاء على قيد الحياة عن طريق قسمة عدد المستعمرات على لوحة LB الانتقائية على عدد المستعمرات على لوحة LB غير انتقائية. في حين أن هذه النسبة المئوية عادة ما تكون منخفضة جداً عند تنفيذها مع مكتبات SP Cas9، يمكن أن تثري الضربات الإيجابية الحقيقية بتكرار الشاشة مع تجمع الباقين على قيد الحياة. تظهر شاشة Snyper التمثيلية معدل بقاء 100٪ يتم الحصول عليه بعد الشاشة الثالثة.

يمكن إجراء عمليات نقل باستخدام RNPs أو plasmid المشفرة Snyper Cas9 لأهداف مختلفة ، والأنشطة الناتجة عن ذلك على الهدف وخارجها تقاس بالأهداف أمبريكون التسلسل. في معظم الأهداف، Snyper Cas9 يظهر نفس المستوى من على الأنشطة المستهدفة ونسب تحديد أعلى مقارنة مع نوع البرية. ويمكن أيضاً استخدام SGRNAs المبتورة لزيادة تحسين التحديد.

أعلى كفاءة التحول في خطوة التنظيف الأولى من المهم جدا عدم فقدان المستنسخين مع خصوصية عالية. في وقت لاحق خطوات الفرز تكرار أقل كفاءة التحول منذ يتم بالفعل المخصب استنساخ في الخطوة الفرز الأولى، وهناك فرصة أقل من فقدانها. سيكون هناك أكثر من استنساخ واحد وجدنا في شاشة Snyper.

وينبغي وصف الأنشطة على الهدف وخارج الهدف من هذه المستنسخات في العديد من الأهداف المختلفة ممكن لاختيار المستنسخين مع أفضل أداء. بهذه الطريقة، يمكن للعلماء تحسين خصوصية الإنزيمات الشبيهة بـ Cas9 دون فقدان النشاط على الهدف. بالإضافة إلى ذلك، لا يحتاج العلماء إلى أي معرفة مسبقة حول بنية البروتين لإجراء تحسينات.