الخياطة في فيفو الاختبارات الخلوية لدراسة المناعي في الأورام الخاصةCD8 + T الاستجابات الخلية

يمكن استخدام هذا الفحص لتحديد السمية الخلوية بوساطة الخلايا التائية مقابل اثنين من epitopes الببتيد المتميزة من مستضدات الورم في وقت واحد. في طبيعة الجسم الحي من هذا الفحص يسمح لوظيفة السامة للخلايا من الخلايا التائية التي يمكن قياسها داخل العمارة سليمة من الجهاز اللمفاوي الثانوي. وبالإضافة إلى ذلك، فإن القتل الملاحظ هو انعكاس دقيق للعدد المطلق للخلايا التائية، وليس فقط تردداتها، التي يمكن أن تكون مضللة.

هذا الفحص يتيح فحص استجابات الخلايا التائية السامة للخلايا لمستضدات الورم المناعية وشبه المهيمنة. ولذلك فهو يوفر معلومات قيمة عند تصميم لقاح، فضلا عن بروتوكولات العلاج المناعي للسرطان. وقد تم تصميم بروتوكول لدينا لدراسة ردود الخلية CD8 T.

ومع ذلك، يمكن تعديلها لقياس السمية الخلوية التي تثيرها أنواع الخلايا القاتلة الأخرى، مثل خلايا NK واللمفاوية T الشبيهة بالفطرة. هذا الفحص يتطلب خبرة في تقنية معقمة, الماوس معالجة الأنسجة, الإعدادية الخلية المستهدفة, فضلا عن الخبرة في حقن الوريد الذيل. يحتاج المرء إلى اكتساب هذه المهارات قبل محاولة في قتل في الجسم الحي.

مرة واحدة في T-antigen-الإيجابية أتباع خط الخلايا السرطانية أصبح التقاء تماما أو قليلا أكثر من التقاء, بلطف شطف monolayer مع عقيمة, PBS الحارة, وفصل الخلايا السرطانية مع 0.25٪ التربسين EDTA في مجلس الوزراء السلامة البيولوجية. اضغط على جوانب قارورة الثقافة عدة مرات لتحرير الخلايا المتبقية من أتباع، ووقف رد فعل بعد حوالي خمس دقائق مع إضافة خمسة ملليلترات من المتوسط DMEM. Pipette حل الخلية عدة مرات قبل تصفية تعليق الخلية من خلال مصفاة خلية 70 ميكرومتر المسام في أنبوب مخروطي 50 ملليلتر.

جمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي، وإعادة تعليق بيليه في 10 ملليلتر من العقيمة، برنامج تلفزيوني الباردة لأول ثلاثة يغسل تحت نفس الظروف. بعد الغسيل الثالث، resuspend الخلايا في أربع مرات 10 إلى الخلايا السبع لكل ملليلتر من تركيز PBS العقيمة، وحقن 500 ميكرولترات من T-antigen إيجابية تعليق الخلايا داخل الصفاق في كل ستة إلى 12 أسبوعا C57 الأسود 6 المتلقي الماوس. لإعداد الطحال الهدف، ضع فأر المتبرع القتل الرحيم في الوضع المعرض، ورش الحيوان بالإيثانول بنسبة 70٪.

باستخدام ملقط معقم ومقص، ورفع الجلد وجعل شق متوسط البطنية الصغيرة. قطع الجلد بطريقة تشبه الصليب لفضح الصفاق، واستخدام ملقط لسحب ما يصل الصفاق بطريقة خيمة مثل، دون اصطياد أي من الأعضاء الداخلية. قطع فتح الصفاق لفضح تجويف الصفاق، ونقل بلطف الطحال إلى 15 ملليلتر طاحونة الأنسجة Dounce تحتوي على خمسة ملليلتر من برنامج تلفزيوني عقيم.

استخدام المكبس لتطبيق الضغط اليدوي حتى يتبدد الأنسجة الزليني في تعليق خلية حمراء متجانسة، ونقل التجانس إلى أنبوب 15 ملليلتر. جمع تعليق من قبل الطرد المركزي، وإعادة تعليق بيليه في أربعة ملليلتر من كلوريد الامونيوم ليسين العازلة للقضاء على كريات الدم الحمراء. بعد أربع دقائق، وقف العملية مع ثمانية ملليلتر من المتوسط الكامل، وتصفية تعليق الخلية من خلال مصفاة خلية 70 ميكرومتر المسام في أنبوب جديد 50 ملليلتر.

فصل خلايا الدم البيضاء من حطام خلايا الدم الحمراء عن طريق الطرد المركزي، وإعادة تعليق بيليه في 12 ملليلتر من المتوسط الكامل. ثم تقسيم تعليق splenocyte إلى ثلاثة متساوية أربع ملليلتر aliquots. لترميز الببتيد من الطحال المستهدفة، نبض واحد جهينوسيتي aliquot مع ميكروموللار واحد من الببتيد غير ذي صلة، aliquot واحد مع ميكرومولار واحد من ببتيد الموقع الأول، و aliquot واحد مع ميكرومولار واحد من ببتيد الموقع الرابع لمدة ساعة واحدة في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون.

في نهاية الحضانة ، قم بإزالة الببتيد الزائد عن طريق الطرد المركزي وغسل الطحال الببتيد النبضية مرتين في 12 ملليلتر من PBS العقيمة والباردة لكل غسل لكل أنبوب. بعد الغسيل الثاني، إعادة تثبيت الخلايا في أربعة ملليلتر من برنامج تلفزيوني جديد ومعقم لكل أنبوب. إضافة 025، 0.25، وCFSE اثنين من micromolar في غير ذي صلة، الموقع الأول، والموقع الرابع الببتيد نبضي الطحال تعليق على التوالي.

ضع الأنابيب عند درجة 37 مئوية لمدة 15 دقيقة مع انعكاس يدوي مرة واحدة كل خمس دقائق. في نهاية الحضانة، إضافة ثلاثة ملليلتر من مصل البقر الجنينية المعطل للحرارة إلى كل أنبوب لوقف رد فعل CFSE وجلب الحجم النهائي في كل أنبوب تصل إلى 15 ملليلتر مع برنامج تلفزيوني. ثم جمع الخلايا التي تحمل علامة صبغ عن طريق الطرد المركزي لاثنين من يغسل في 12 ملليلتر من الطازجة، معقمة PBS لكل غسل.

لتأكيد تسمية CFSE كافية من الطحال المستهدفة، resuspend بيليه في ثلاثة ملليلتر من برنامج تلفزيوني وخلط مع دوامة لطيف. نقل 10 ميكرولترات من كل تعليق الخلية المسمى CFSE إلى فردي جولة خمسة ملليلتر أسفل بوليستيرين الفلورين تنشيط فرز الخلايا، أو أنبوب FACS، التي تحتوي على PBS، وتحميل الأنبوب على تدفق الجهاز الخلوي مجهزة ليزر 488 نانومتر. في برنامج جهاز قياس الخلايا التدفقي، قم بإنشاء بوابة الخلايا اللمفاوية استنادًا إلى خصائص التشتت الجانبي والتشتت الجانبي للخلايا قبل الحصول على 5000 حدث تقع ضمن بوابة الخلايا اللمفاوية في قناة Fluorescence 1.

ضمن السكان الأم CFSE إيجابية، رسم بوابات رسم بياني إضافية لتحديد الفئات الفرعية CFSE-المنخفضة، CFSE المتوسطة، وCFSE-عالية. ثم تأكيد عدد الحدث على قدم المساواة أو شبه متساوية داخل البوابات الثلاث لأنابيب اثنين آخرين من الخلايا المسماة. لحقن الخلايا المستهدفة، دوامة البداية بلطف أنابيب المصدر وتجمع ثلاثة تعليق الخلايا المسمى CFSE في أنبوب جديد بنسب متساوية.

أعلى محتويات أنبوب مع برنامج تلفزيوني عقيمة، وجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي للعد. ثم ضبط وحدة التخزين إلى 10 مرات واحدة إلى الخلايا المستهدفة المختلطة السبع لكل 200 ميكرولتر من PBS لكل تركيز المتلقي ، وحقن 200 وحدة تخزين ميكرولتر من تعليق الخلية في الوريد الذيل لكل مستلم C57 الأسود 6 الماوس. بعد ساعتين أو أربع ساعات من الحقن ، وإزالة ومعالجة الطحال من كل المتلقي كما هو موضح ، وإعادة ربط خلايا الدم البيضاء المعزولة في ثلاثة ملليلتر من برنامج تلفزيوني لكل طحال.

نقل ما يقرب من واحد مرات 10 إلى الخلايا السبع من كل طحال المعالجة في أنبوب FACS نظيفة، وتشغيل الخلايا على الفور على مقياس تدفق الخلايا كما هو موضح لبوابة مجموعات الخلايا المستهدفة CFSE منخفضة، وسيطة، وعالية الهدف. ثم الحصول على ما مجموعه 2،000 الأحداث CFSE المنخفضة في قناة Fluorescence 1، وحساب تحلل محددة من كل مجموعة الخلايا المستهدفة cognate وفقا للصيغة مفصلة في النص. في هذه التجربة التمثيلية ، تم تأكيد نجاح استنفاد الخلايا التائية التنظيمية التي تحدث بشكل طبيعي في الفئران المحقونة بالأجسام المضادة أحادية النسيلة CD25 بواسطة عملية استئصال الخلايا المتدفقة.

وكما هو متوقع، يمكن اكتشاف قمم شبه متساوية تقابل الخلايا المستهدفة الخاضعة للمراقبة والخلايا المستهدفة في الفئران الساذجة. وعلى النقيض من ذلك، كانت الخلايا المستهدفة التي تعرض الموقع IV غائبة تمامًا تقريبًا في الفئران المُعدّة لـ T-antigen، بغض النظر عن علاجها السابق بالأجسام المضادة أحادية النسيلة CD25 أو PBS. ومن المثير للاهتمام، التي تحدث بشكل طبيعي T ريج استنزاف الخلايا المضادة لـ CD25 أحادية النسيلة المعززة في الجسم المضاد للخلايا ال vivo T-lymphocyte-تحلل الخلايا المستهدفة الموقع-I-نبض.

في هذا التحقيق التمثيلي الثاني ، برمجت الموت 1 الحصار تعزيز السيطرة دون المهيمنة CD8 إيجابية T الخلية مواقع واحدة واثنين من خفض ثلاثة ردود محددة ، مما يشير إلى أن التدخل في الموت المبرمج 1 / مبرمجة التفاعلات ligand الموت 1 قد تحفز epitope انتشار في المضادة للسرطان CD8 إيجابية ردود الخلية T. من المهم للغاية عند وضع علامة على الخلايا المانحة باستخدام CFSE ، تأكد من دقة تركيزاتك. وإلا فإن هذا قد يؤدي إلى تداخل قمم الرسم البياني، مما يجعل الحسابات المطلوبة وتفسير البيانات صعبة، إن لم يكن مستحيلا.

سيكون من المهم لتحسين في vivo cytotoxicity المقايسة لتحديد وظائف المفعول التي أثارها مختلف أنواع الخلايا القاتلة التي تعترف مستضدات الببتيد وغير الببتيد في نفس المضيف.