استخدام خلايا Drosophila S2 للتصوير الحي لقسم الخلايا

يمكن استخدام بروتوكولنا لتحديد الأحداث الديناميكية المكانية والزمنية أثناء الانقسام ، ويمكن استخدامه أيضًا لتصور آثار المنظمين ال mytotic في الوقت الفعلي. استخدام التصوير المزدوج للألوان يسمح بتحليل متزامن لعلامتين الجزيئية. على سبيل المثال، يمكننا تصور ميكروتومات من المغزل اليوتوني والبنية الأساسية الحركية للكروموسومات المنسوخة.

للحث على التعبير البروتين الفلوري, بعد أربعة أيام من العلاج تدخل الحمض النووي الريبي, فضح غير قابل للتكرير metallo-thyanin المروّج الخلايا العابرة لتركيز نهائي من 500 كبريتات النحاس ميكرومولار لمدة 24 إلى 36 ساعة. لتحضير البروتين الفلوري الذي يعبر عن خلايا للتصوير، قم بنقل الخلايا إلى أنبوب معقمة 15 ملليلتر، وبعد عدها، تترسب الخلايا عن طريق الطرد المركزي. Resuspend بيليه في الطازجة، 25 درجة مئوية درجة دافئ سيم، تستكمل مع 10٪ FBS، في مرتين 10 إلى 6 خلايا في المليلتر التركيز، وعلاج الخلايا مع إضافية 500 كبريتات النحاس micromolar.

ثم إضافة 200 إلى 500 ميكرولترات من الخلايا إلى بئر واحد من غرفة الخلية متعددة يعيش بشكل جيد، ووضع الغرفة على مرحلة المجهر الفلورسنت المقلوب. بينما تستقر الخلايا في الغرفة، افتح برنامج تصوير الخلايا الحية وانقر فوق جديد والتجربة. لإدراج حلقة الفاصل الزمني التي سيتم التقاط الصور فوق رمز حلقة الفاصل الزمني.

تعيين الفاصل الزمني إلى ثوان، وتقسيم المطلوب طول التجربة الشاملة في ثوان على الفاصل الزمني لتعيين عدد الدورات. السماح تكرار الحلقة خلال الفترة الزمنية الإجمالية المطلوبة. لإدراج فحص التركيز تحت الحمراء للحفاظ على التركيز الهدف، انقر فوق رمز الحركة س ص وحدد Z الانجراف التعويض لإضافة Z الانجراف خطوة التعويض داخل الوقت الفاصلة حلقة طبقة.

للسماح بالحصول على صورة متعددة القنوات، انقر فوق رمز مجموعة القنوات المتعددة لإضافة طبقة مجموعة متعددة القنوات، وانقر فوق أيقونة إضافة حلقة مكدس Z لإضافة طبقة حلقة مكدس Z. ثم قم بتعيين حجم الخطوة المطلوبة وعدد الشرائح، وتعيين التعرض لكل قناة إلى أدنى مستوى ممكن لتقليل تبييض الصور. لتصوير انقسام الخلايا، حدد هدف غمر الزيت 40 أو 60 مرة، وقناة mCherry florescence، وقم بمحاذاة الهدف على طول الجزء العلوي أو السفلي من البئر.

ثم الابتعاد عن مقسم جيدا عمودي لتجنب التدخل في خطوة التعويض ز الانجراف. حدد موقع خلية أو خلايا في مرحلة G2 أو M المبكرة المتأخرة، وانقر فوق الزر عرض مباشر لبدء عرض الخلايا في شاشة البرنامج. إن العثور على الخلايا المناسبة في انتقال G2 إلى M هو المفتاح لتصوير انقسام الخلايا.

حدد موقع خلية مع نواة سليمة واثنين من centrosomes بالضبط للحصول على أفضل النتائج. باستخدام مقبض التركيز غرامة من المجهر، والتركيز على الخلايا من الفائدة وانقر فوق تعويض البحث عن مجموعة الأشعة تحت الحمراء الاختيار التركيز. انقر فوق بدء لبدء برنامج التصوير الفاصل الزمني، وحدد القناة المطلوبة وضبط الشدات بكسل متوسط لضبط المدرجات البيانية حسب الضرورة، لتصور بوضوح الخلايا ذات الاهتمام.

تحقق من الخلايا بعد 15 إلى 20 دقيقة للتأكد من أن المغلف النووي قد حدث، كما يحددها اختفاء بقعة مستديرة، منكسرة بالقرب من مركز الخلية. بعد 15 إلى 20 دقيقة أخرى، تحقق لتحديد ما إذا كان قد حدث ظهور الphase. ثم إيقاف البرنامج وحفظ الملف.

لتحديد انهيار المغلف النووي إلى توقيت بداية الطور، انقر فوق زر الإطار لأعلى لتحديد وقت تعطل المغلف النووي ووقت فصل الكروموسوم الأولي في دقائق، وطرح وقت الانهيار من وقت البدء للحصول على انهيار المغلف النووي إلى وقت بداية الطور لخلية معينة. ثم استمر في المسح بحثاً عن خلايا ما قبل التقسيم للحصول على أطراف متعددة لحالة معينة لمدة تصل إلى 12 ساعة من التسوية الأولية. يمكن استهداف الخلايا التي هي على وشك الانقسام من خلال وجود اثنين من centrosomes ونواة سليمة، كما هو مبين من قبل الضوء المنكسر وبقعة أغمق داخل الخلية عندما ينظر إليها في قناة توبولين ألفا.

يمكن تصور انهيار المغلف النووي من خلال اختفاء هذه البقعة المظلمة ، مما أدى إلى تلوين موحد للcytoplasm. بعد انهيار المغلف النووي، يمكن قياس الوقت الذي تستغرقه كل خلية لتشكيل المغزل وإلى الكونغرس وفصل الكروموسومات من خلال الإشارة إلى النقاط الزمنية لهذه الأحداث بالنسبة لتعطل المغلف النووي. العلاج مع مزدوجة تقطعت بهم السبل RNA المستهدفة ضد shortstop، بروتين التشابك المتناهى للفعل يشتبه في أن تؤثر على ديناميات دورة الخلية النتائج في تأخير mytotic كبيرة.

ينتج عن هذا العلاج تأخير كبير، حيث تقوم العديد من الخلايا بالاعتقال عند الphase ولا تنتقل أبدًا إلى الphase خلال تجربة التصوير التي تستغرق ساعتين إلى ثلاث ساعات. العلاج المشترك مع RNA مزدوجة تقطعت بهم السبل ضد النار والصفقة الخام، وهو عنصر مهم من هذا الحاجز، يؤدي إلى قمع النمط الظاهري اعتقال، مما أدى إلى انهيار المغلف النووي إلى أوقات الphase مماثلة للرقابة، والخلايا غير المعالجة. تأكد من تحديد الخلايا المناسبة، ولا تضيع الوقت التصوير الخلايا التي لا تبدأ الانقسام.

إذا لم تبدأ الخلية في الانقسام خلال 20 دقيقة، ابحث عن خلية أخرى. يمكن للباحثين اتباع هذا الإجراء للمساعدة في تحديد المنظمين الويتية الجديدة، أو ربما المركبات الجافة الجديدة التي تؤثر على أحداث محددة في انقسام الخلايا.