إنشاء نموذج بورسين السابقين فيفو القرنية لدراسة العلاجات الدوائية ضد التهاب القرنية البكتيرية

يوفر نموذج التهاب القرنية الخنازير خارج الجسم الحي المقدم هنا للباحثين الذين يطورون مضادات ميكروبات جديدة نموذجا تمثيليا في المختبر لتحديد فعالية مضادات الميكروبات بدقة أكبر في المراحل قبل السريرية. لقد استخدمنا Pseudomonas aeruginosa في هذه التجربة ، لكن النموذج يعمل أيضا بشكل جيد مع البكتيريا والكائنات الحية الأخرى مثل الفطريات والخميرة. استخدم ملقطا معقما لنقل مقلة العين إلى طبق بتري.

قم بإزالة الملتحمة والأنسجة العضلية حول مقلة العين باستخدام شفرة المشرط رقم 15 والملقط. ثم أثناء الإمساك بالعصب البصري بالملقط ، ارفع مقلة العين برفق وانقلها إلى وعاء سعة نصف لتر مملوء ب PBS المعقم. بمجرد تنظيف جميع مقل العيون من الأنسجة المحيطة ، استخدم ملقطا معقما لنقلها إلى جرة أخرى سعة نصف لتر مملوءة باليود 3٪ في PBS.

بعد أن تكون مقل العيون في البرطمان لمدة دقيقة واحدة ، انقلها إلى جرة ثالثة تحتوي على PBS معقم. ضع مقلة العين على طبق بتري نظيف واستخدم الملقط لإثباته. باستخدام شفرة مشرط رقم 10A ، قم بعمل قطع بالقرب من القرنية.

استخدم المقص لاستئصال القرنية تاركا حوالي ثلاثة ملليمترات من الصلبة المحيطة بها. تأكد من أن الطرف الحاد للمقص في المساحة فوق القشرة ولا يخترق القزحية. امسك زر الصلبة القرنية بالملقط واستخدم زوجا آخر من الملقط النهائي المدبب لفصل الأنسجة العنبية برفق.

ثم ارفع زر الصلبة القرنية لفصله عن باقي مقلة العين. اشطف الزر لفترة وجيزة في محلول 1.5٪ من بوفيدون اليود في PBS. ثم ضع الزر في PBS معقم في طبق مكون من 12 بئرا.

بعد معالجة ما لا يزيد عن 40 مقلة عين ، ضع كل زر من الصلبة القرنية في طبق بتري الخاص به مقاس 34 ملم مع الجانب الظهاري لأعلى. أضف إلى كل طبق ثلاثة ملليلتر من وسط الثقافة المسخن مسبقا إلى 37 درجة مئوية. احتضان أطباق بتري لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية في حاضنة زراعة الأنسجة المرطبة.

استخدم تقنية معقمة لإزالة الوسائط من أطباق بتري واستبدالها بثلاثة ملليلتر من وسائط الاستزراع الطازجة المسخنة مسبقا التي تحتوي على المضادات الحيوية. بعد احتضان القرنيات لمدة 48 ساعة ، قم بإزالة الوسائط مرة أخرى واشطف القرنيات بملليلترين من PBS. ثم أضف الوسائط الخالية من المضادات الحيوية واحتضنها لمدة يومين إلى ثلاثة أيام لإزالة المضادات الحيوية المتبقية من الأنسجة.

قم بتغيير الوسائط مرة أخرى على الأقل خلال هذه الأيام الثلاثة. تخلص من القرنيات إذا ظهرت أي تعكر في الوسط الخالي من المضادات الحيوية. أضف 10 مل من LB إلى قارورة مخروطية سعة 50 مليلتر مع سدادة رغوية.

بتلقيح المرق بمستعمرة من P.aeruginosa من طبق أجار طازج واحتضانه عند 37 درجة مئوية لمدة ثلاث إلى أربع ساعات حتى تصبح البكتيريا في منتصف مرحلة السجل. انقل المزرعة البكتيرية إلى أنبوب سعة 50 مليلتر وقم بطردها بمعدل 3 ، 000 مرة جم لمدة خمس دقائق. قم بإزالة المادة الطافية وإعادة تعليق حبيبات الخلية في PBS.

بعد غسل الخلايا مرتين أخريين وتعليقها في PBS ، اضبط الكثافة البصرية للتعليق عند 600 نانومتر إلى حوالي 0.6 باستخدام PBS المعقم كفارغ. قم بإزالة الوسائط من طبق بتري واشطف القرنيات مرتين باستخدام مليلتر واحد من PBS المعقم. امسك القرنية بالملقط واضغط برفق.

استخدم مشرط 10A لعمل أربع قطع ، اثنتان رأسيتان ، اثنتان أفقيتان في القسم المركزي من زر الصلبة القرنية من خلال الطبقة الظهارية إلى السدى الأساسي. ضع قالبا زجاجيا معقما في طبق من ستة آبار مع الجزء العريض لأعلى. ثم ضع القرنية في منتصف القالب الزجاجي بحيث يكون جانب الظهارة متجها لأسفل والجزء المصاب من القرنية في القالب الزجاجي.

املأ القالب الزجاجي بالكامل بإضافة مليلتر واحد من محلول الأجار. بعد السماح للأجار بالتماسك ، اقلب القالب الزجاجي بحيث تكون ظهارة القرنية متجهة لأعلى. يجب إغلاق القالب الزجاجي بأجار حتى أسنانه لمنع تسرب اللقاح أو محلول الدواء.

ماصة 200 ميكرولتر من الثقافة البكتيرية مباشرة في منطقة مقطوعة. أيضا لكل تجربة ، قم بإعداد عنصر تحكم عن طريق إضافة 200 ميكرولتر من PBS المعقم إلى قرنية واحدة بدلا من إضافة الثقافة البكتيرية. بعد ذلك ، أضف 185 ميكرولترا من PBS إلى الجزء العلوي من كل قرنية للحفاظ على رطوبة الظهارة.

ثم أضف ملليلتر واحد من DMEM بدون مضادات حيوية إلى قاع كل بئر. احتضان الصفيحة المكونة من ستة آبار عند 37 درجة مئوية مع الرطوبة وثاني أكسيد الكربون 5٪ لمدة تصل إلى 24 ساعة. تخلص من DMEM من اللوحة المكونة من ستة آبار ومليلتر واحد من PBS المعقم إلى كل بئر لشطفه.

قم بإزالة PBS برفق دون لمس الجزء المركزي من زر القرنية. قم بإزالة القالب الزجاجي باستخدام ملقط معقم وضعه في 5٪ Distel. اشطف الجزء العلوي من زر الصلبة البديلة برفق مرتين باستخدام مليلتر واحد من PBS.

استخدم ملقطا رفيعا لرفع حافة زر القرنية ، وافصله عن الأجار تحته ونقله إلى أنبوب سعة 50 مليلتر مملوء بواحد إلى ملليلترين من PBS المثلج. للمساعدة في فصل البكتيريا عن ظهارة القرنية ومنطقة القطع ، أضف PBS إلى الأنبوب واستخدم الخالط ذو الطرف الدقيق لقص الجزء العلوي من القرنية المصابة. لا يجب تسييل الأنسجة بالكامل.

دوامة لتعليق البكتيريا المستقرة وإضافة 20 ميكرولترا من القرنية المتجانسة إلى 180 ميكرولتر من PBS. ثم قم بإجراء تخفيفات تسلسلية للتجانس في صفيحة 96 بئرا. ماصة 10 ميكرولتر من الجانس المخفف على صفيحة أجار الدم.

بعد احتضان اللوحة لمدة 16 ساعة ، احسب عدد وحدات تشكيل المستعمرة. عادة ما تنتفخ قرنيات الخنازير بعد بضعة أيام في المتوسط. لم يكن هناك فرق كبير في وحدات تشكيل المستعمرة التي تم الحصول عليها من القرنيات مع وبدون إضافة ديكستران ، والذي يضاف عادة لمنع تورم القرنية.

عادة ما تصاب القرنيات لمساعدة البكتيريا على اختراق الظهارة. على الرغم من عدم وجود فرق كبير في تقدم العدوى بين القرنيات المصابة وغير المرغوب فيها ، إلا أنه كان هناك تباين أكبر بين التكرارات في القرنيات المصابة. غسل القرنيات مرتين باستخدام PBS يزيل البكتيريا الزائدة التي لم تلتصق بالظهارة.

هناك فرق كبير في CFU بين قرنيات الخنازير المغسولة وغير المغسولة المصابة ب P.aeruginosa PAO1 لمدة 24 ساعة. لم يكن هناك فرق كبير في عدد CFU بين قرنيات الخنازير والأرانب المصابة ب PA14 و PAO1. كانت نتائج كلا النموذجين قابلة للتكرار.

بعد 24 ساعة ، تتطور القرنيات المصابة بأي سلالة Pseudomonas دائما إلى التعتيم وتصبح منطقة القطع أكثر وضوحا وانفتاحا مقارنة بالقرنية غير المصابة. يمكن استخدام القرنيات المصابة والمعالجة التي تمت معالجتها بهذه الطريقة في إزالة الشعر بالشمع ، والحفظ بالتبريد ، والتقطيع ، والتلوين بالهيماتوكسيلين وأولسن ، والتلوين المناعي ، والفحص المجهري متحد البؤر. يساهم البروتوكول في زيادة التحكم في تصميم الأدوية وصياغتها في المراحل قبل السريرية ، مما سيزيد من النجاح في التجارب السريرية ، ويقلل من استخدام ، ويؤدي إلى ترجمة أسرع لمضادات الميكروبات الجديدة إلى العيادة.