حقن الجرو والكبار لRNAi و CRISPR تحرير الجينات في Nasonia vitripennis
December 4th, 2020
هنا، ونحن نصف أساليب لحقن الجرو والكبار كفاءة في Nasonia vitripennis كبدائل يمكن الوصول إليها للتحنيم الدقيق الجنين، وتمكين التحليل الوظيفي للجينات ذات الأهمية باستخدام إما الحمض النووي الريبي إسكات عن طريق تدخل الحمض النووي الريبي (RNAAi) أو خروج المغلوب الجينات عن طريق CRISPR / Cas9 تحرير الجينوم.
البحث عن نموذج الحشرات غير المتعارف عليه ، مثل الدبور الطفيلي ، محدود لأن الحقن المجهري الجنيني يمثل تحديا كبيرا. تتجاوز طريقتنا هذه المشكلة ، مما يتيح طفرات السلالة الجرثومية الخاصة بالموقع والوراثية. حقن الشرانق أو الإناث البالغات سريع ويزيل الحاجة إلى المعدات باهظة الثمن أو التدريب المتخصص المطلوب لتحقيق حقن جنيني ناجح.
لن تسمح هذه التقنية لأي مختبرات متخصصة لا يمكنها الوصول إلى معدات باهظة الثمن بإجراء دراسات وظيفية في أي نوع من أنواع الحشرات يستخدمونها كنموذج. بعد التحسين ، يمكن استخدام هذه الطريقة لدراسة علم الوراثة الوظيفي للعديد من الجينات الأخرى في ناسونيا. نعتقد أيضا أنه يمكن استخدام هذه الطريقة لتوصيل الأحماض النووية للتحول الجيني لناسونيا أو الحشرات الأخرى.
ابدأ بإعداد ما يقرب من 20 أنثى متزاوجة بشكل فردي في أنابيب اختبار زجاجية صغيرة موصولة بالقطن. أضف اثنين من مضيفي S.bullata لكل أنبوب وحافظ على الدبابير عند 25 درجة مئوية و 30٪ رطوبة نسبية مع دورة مظلمة فاتحة 12:12 لمدة يومين إلى ثلاثة أيام. بعد يومين إلى ثلاثة أيام ، قم بإزالة الإناث برفق باستخدام فرشاة ذات رؤوس دقيقة لتجنب الوضع المستمر والتزامن في نمو النسل.
يمكن اختياريا إعادة استضافة الإناث التي تمت إزالتها أو تخزينها عند خمس درجات مئوية لمدة تصل إلى شهر. حافظ على المضيف المتطفل عند 25 درجة مئوية ورطوبة نسبية 30٪ مع دورة داكنة فاتحة 12:12 لمدة سبعة أيام إذا كانت مرحلة الحقن المرغوبة تتطلب شرانق بيضاء ، لمدة 13 يوما ، إذا كانت مرحلة النمو المطلوبة هي الشرانق السوداء ، أو 14 يوما للبالغين الصغار الناشئة حديثا. عند الوصول إلى المرحلة المرغوبة ، افتح الشرانق المضيفة بإبرة تشريح لاستعادة الشرانق N.vitripennis والبالغين.
قم بإعداد شريحة زجاجية عن طريق تطبيق خط من الغراء المدرسي في المنتصف. انشر الغراء بإبرة التشريح للحصول على طبقة سميكة ، والتي سيتم استخدامها لمحاذاة الشرانق. اترك الغراء يجف لمدة دقيقتين تقريبا قبل نقل الشرانق.
تحت مجهر تشريح ، استخدم إبرة تشريح لتطبيق الغراء على الجزء الخلفي من رأس الخادرة. اربط الخادرة بطبقة الغراء على الشريحة بحيث يكون بطنها متجها لأعلى. قم بمحاذاة 20 إلى 30 شرانق جنبا إلى جنب على الشريحة.
ضع الشريحة مع الشرانق وطبق بتري للسماح للغراء بالتحرك لمدة 10 دقائق تقريبا. قبل البدء في الحقن ، اختبر التصاق الشرانق بالغراء عن طريق دفعها برفق بإبرة التشريح. إذا تم فك معظم الشرانق ، فقم بإعداد شريحة جديدة.
بدلا من ذلك ، قم بإزالة جميع الشرانق السائبة واستمر في حقن تلك المرفقة بشكل صحيح بالشريحة. قم بتحميل أنبوب زجاجي شعري واحد في مجتذب إبرة واسحب الإبر باتباع تعليمات الشركة المصنعة. قم بتحميل الإبرة بخمسة ميكرولترات من خليط الحقن المحضر باستخدام أطراف ماصة اللودر الدقيق.
افتح الإبرة ، وحرك الطرف على سطح مصنوع من شريحتين متداخلتين. بدلا من ذلك ، افتح طرف الإبرة بزوج من الملقط الدقيق لإنشاء حافة حادة. ضع الشريحة مع الشرانق المحاذاة تحت مجهر تشريح ، ثم أدخل الإبرة في أنبوب حقن الفيمتو جيت وشد رأس المقبض
.بالنظر إلى الإبرة تحت المجهر ، قم بتشغيل femtojet واضبط ضغط التعويض ومعلمات ضغط الحقن عن طريق تدوير المقابض الدوارة. أدخل الإبرة بعناية بين الجزء الثاني والثالث من البطن المرئي بزاوية رأسية تبلغ حوالي 30 درجة. حقن بتدفق مستمر حتى يتحول البطن بالكامل إلى اللون الأخضر في حالة شرانق المرحلة البيضاء أو حتى يزداد حجم البطن في حالة الشرانق السوداء.
توقف عن الحقن عندما يكون من الواضح أن البطن لا يمكنه تناول المزيد من السوائل أو عندما يبدأ السائل في التدفق خارج الجسم. انتقل بحذر إلى الخادرة التالية وكرر هذه الخطوات. انقل الشريحة مع الشرانق المحقونة إلى طبق بتري.
غطي الطبق بغطاءه وضعيه على حرارة 25 درجة مئوية حتى يظهر الدبور. لتحضير البالغين ، افصل مجموعات من 20 أنثى عذراء في أنبوب اختبار صغير نظيف بفرشاة طلاء دقيقة. ضع شريحة زجاجية فوق الثلج وقم بمحاذاة الأنثى جنبا إلى جنب على الشريحة الباردة بحيث تكون البطن متجهة لأعلى تحت نطاق تشريح.
قم بتحميل إبرة واحدة بمحلول البروتين النووي الريبي باستخدام طرف التحميل الدقيق وأدخل الإبرة في حزمة الموصل الخاصة بمجموعة أنبوب الشفاطة. ادعم الإناث من الجانب الآخر بإبر تشريح ضعيفة ، مع الحقن ببطء في البطن. تجنب لمس مبيض.
سيؤدي ذلك إلى إلحاق أضرار جسيمة بهذا الهيكل التناسلي الحرج. أدخل الإبرة بعناية بين الجزء الثاني والثالث من البطن المرئي بزاوية رأسية تبلغ حوالي 30 درجة. حقن المحلول في بطن الأنثى ، والتوقف عندما لا يمكن دخول المزيد من السائل أو عند ملاحظة تسرب المحلول الفائض.
انتقل بحذر إلى الأنثى التالية وكرر هذه الخطوات. عند الانتهاء ، انقل أنثى واحدة محقونة برفق إلى أنبوب جديد مع مضيف واحد باستخدام فرشاة الرسم. اتركهم للتعافي في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة تقريبا ، وتأكد من البقاء على قيد الحياة ، وأعد الأنابيب إلى حاضنة التربية.
بعد استئصال البالغين من الشرانق المحقونة ، ضع الدبابير المفردة في كوب لتوصيلها بالقطن وأدخل مضيفا واحدا من S.bullata. بالنسبة لتجارب CRISPR / Cas9 بالضربة القاضية ، اسمح للإناث بتطفل المضيف ليوم واحد واستبدال المضيف كل يوم لمدة ثلاثة أيام متتالية. ضع المضيف المتطفل ، واضبطه على حرارة 25 درجة مئوية حتى ظهور ذرية الذكور G0 ، حوالي 13 إلى 14 يوما.
تحت مجهر تشريح ، قم بفحص G0 للذكور بحثا عن الأنماط الظاهرية المتحولة. جين الزنجفر مسؤول عن تصبغ العين. الدبابير ذات العيون البنية من النوع البري والدبابير ذات العيون الحمراء الزاهية أو الاختلافات بين العيون الحمراء والبنية هي طفرة.
يمكن استخدام هذا البروتوكول إما للحقن المجهري للعذراء أو البالغين. تتراوح معدلات البقاء على قيد الحياة لهذا الإجراء من 15 إلى 100٪ ، كما تظهر هنا كفاءة تحقيق النمط الظاهري المطلوب عبر RNAi أو CRISPR دون الحاجة إلى حقن بويضات شاقة. عند حقن الشرانق أو الإناث البالغات ، يجب أن تكون الإبرة حادة ويتم إدخالها بطريقة لا يتسرب السائل مباشرة بعد الحقن.
إذا حدث هذا ، فقم بإزالة الإبرة ، وتأكد من أن الطرف ناعم وحاد ، وقم بتغييره إذا لزم الأمر أو حقنه في مكان مختلف. يمكن إجراء تحليل الوظيفة على الجين ذي الأهمية المستهدف من هذا الإجراء. سيجيب هذا على سؤال حول وظيفة الجينات وما إذا كان الجين ضروريا للنمط الظاهري المحدد الذي تمت دراسته.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
نظرة عامة
تقدم هذه الدراسة طريقة لإجراء حقن الطور اليرقي والطور البالغ بكفاءة في Nasonia vitripennis، مما يوفر بديلاً عمليًا للحقن المجهري الجنيني التقليدي. تتيح هذه التقنية التحليل الوظيفي للجينات من خلال تداخل الحمض النووي الريبي (RNAi) وتحرير جينوم CRISPR/Cas9.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال البحث
- الهندسة الوراثية في نماذج الحشرات غير التقليدية
- الوراثة الوظيفية لـ Nasonia vitripennis
- تطبيقات تقنيات RNAi وCRISPR/Cas9
الخلفية
- التحديات في الحقن المجهري الجنيني لذباب الطفيل
- الحاجة إلى طرق ميسورة في الدراسات الوراثية
- أهمية استخدام Nasonia ككائن نموذجي
الطرق المستخدمة
- تقنيات حقن الطور اليرقي والطور البالغ للتلاعب الجيني
- Nasonia vitripennis كنظام بيولوجي
- استخدام تقنيات RNAi وCRISPR/Cas9
النتائج الرئيسية
- التنفيذ الناجح لطريقة الحقن بمعدلات بقاء عالية (15-100%)
- ملاحظة الأنماط الظاهرية المرغوبة من خلال تحرير الجينات
- التحقق من فعالية RNAi وCRISPR دون إجراءات معقدة
الاستنتاجات
- توضح الطريقة تقدمًا كبيرًا في مجال علم الوراثة للحشرات
- تفتح آفاقًا جديدة للدراسات الوراثية الوظيفية في أنواع الحشرات المختلفة
الأسئلة المتداولة
Executive Industry Relevance
Functional genetic validation in non-canonical insect models is constrained by embryonic microinjection challenges, limiting target de-risking in early discovery. This pupal and adult injection method enables site-specific and heritable germline edits without specialized equipment, supporting scalable target validation workflows. It expands mechanistic screening capacity for parasitoid wasps and related species, improving predictive confidence in pathway interrogation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of gene function in Nasonia vitripennis to validate therapeutic targets in epigenetics, symbiont interactions, and venom pathways.
- Operational Value: Eliminates need for embryonic microinjection expertise and costly equipment, reducing barriers to target validation in non-model insects.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Produces quantifiable phenotypic outputs (e.g., eye color mutations) for RNAi and CRISPR screening assays.
- Operational Value: Standardizes injection procedures across pupal and adult stages, improving reproducibility for compound or guide RNA evaluation.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports disease-relevant system modeling by enabling functional genetics in a haplo-diploid sex determination model with translational relevance to genetic conflict and speciation.
- Operational Value: Facilitates continuity from target hit to preclinical-like validation through heritable germline mutation generation.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by enabling target hypothesis testing prior to lead identification, particularly for invertebrate-derived targets or symbiont-mediated mechanisms.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification and biological de-risking through direct gene knockout or knockdown in vivo.
- Screening: Enables assay-ready biological systems with standardized delivery of RNAi or CRISPR reagents for phenotypic screening.
- Analytics: Generates measurable phenotypic readouts (e.g., eye pigmentation shifts) to compare experimental conditions and assess editing efficiency.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by establishing heritable mutant lines for multi-generational phenotypic assessment.
- Enterprise Reuse: Provides a reusable injection platform adaptable across insect species, reducing revalidation costs for cross-functional teams.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by enabling direct functional assessment of genes in vivo.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization through slide-based alignment and consistent injection parameters.
- Strategic Value: Reduces late-stage biological risk by improving target confidence early in the discovery pipeline.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of targets from non-canonical models through accessible functional validation.
Implementation Considerations
- Requires expertise in insect dissection and microinjection techniques under dissecting microscopy.
- Depends on capillary needle preparation and injection apparatus (e.g., femtojet) for precise reagent delivery.
- Necessitates standardized host parasitization and environmental controls (25°C, 30% RH, 12:12 light cycle) for developmental staging.
- Involves adaptation considerations for varying insect sizes and cuticle thickness when extending to other species.
- Limited by survival rate variability (15–100%) dependent on injection precision and post-procedure handling.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
1:04
Nasonia Rearing
2:19
Alignment of White and Black Pupae
3:21
Needle Preparation
3:53
Adult Injection with Aspirator Tube
5:04
Adult Injection with Aspirator Tube
6:32
Post-Injection Care and Mutant Screening
7:27
Results: Survival and Efficiency Rate of RNAi and CRISPR/Cas9 via Pupal and Adult Injections
7:52
Conclusion
