إنتاج أجسام مضادة وحيدة النسيلة تستهدف أمينوببتيداز N في ظهارة الغشاء المخاطي المعوي الخنازير

تستخدم الأجسام المضادة وحيدة النسيلة المشتقة في المقام الأول في الكواشف المناعية العلاجية التشخيصية التي تسلط الضوء على الحاجة إلى إنتاج أجسام مضادة مستقرة وموثوقة في إنتاج محدود معد. أثبتت الطرق الموصوفة هنا أن إنتاج الأجسام المضادة المؤتلفة يمكن أن يزيد من كفاءة إنتاج الأجسام المضادة وحيدة النسيلة ويقلل من تكاليف العمالة والوقت المرتبطة به. تستخدم الطرق لتطوير اتحادات الأدوية القائمة على aminopeptidase والأجسام المضادة وغيرها من المنتجات العلاجية ، مما يساعد في توضيح دور APN في الوقاية والعلاج من الالتهابات البكتيرية والفيروسية.

سيكون عرض الإجراء يان لي ، طالب دراسات عليا من مختبري. للبدء ، حقن 100 ميكروغرام من بروتين APN داخل الصفاق في الفئران الإناث البالغة المختارة لتعزيز المستضد النهائي. بعد ثلاثة أيام من الحقن ، اجمع الطحال من الفئران واغسله باستخدام DMEM مرتين لإزالة الدم والخلايا الدهنية.

قم بتصفية معلق خلايا الطحال باستخدام شبكة نحاسية 200 شبكة لإزالة حطام الأنسجة وحصاد خلايا الطحال باستخدام الطرد المركزي لإزالة غشاء الطحال. قم بزرع خلايا الورم النقوي SP20 للفأر في قارورة مساحتها 25 سم مربع تحتوي على خمسة ملليلتر من DMEM مكملة بمصل بقري جنيني بنسبة 6٪ واستزراع الخلايا عند 37 درجة مئوية و 6٪ جو من ثاني أكسيد الكربون للحفاظ على صلاحية الخلية. بعد خمسة إلى ستة أيام من المزرعة ، يجب أن تصل الخلايا إلى 80 إلى 90٪ من التقاءها بعد الإنعاش وتظهر مستديرة ومشرقة وواضحة تحت المجهر.

قبل يوم واحد من التهجين ، اجمع البلاعم من التجاويف البريتونية للفئران. البلاعم البريتونية للبذور بكثافة تتراوح من 0.1 إلى 0.2 مرة من 10 إلى الخامس لكل ملليلتر في 96 صفيحة بئر ، تحتوي كل منها على 100 ميكرولتر من وسط HAT وتحتضنها طوال الليل. للتهجين ، قم باستنشاق خلايا SP20 برفق باستخدام ماصة من 8 إلى 10 زجاجات وعلقها في 10 ملليلتر من وسط DMEM الخالي من المصل.

اغسل الخلايا باستخدام DMEM الطازج وأجهزة الطرد المركزي مرتين ، ثم أعد تعليقها في 10 ملليلتر من DMEM. امزج خلايا الطحال الكمية مع خلايا SB20 بنسبة 10: 1 وانقلها إلى أنابيب سعة 50 ملليلتر. بعد الطرد المركزي ، تخلص من المادة الطافية واجمع الكريات في قاع الأنابيب.

اضغط على الأنبوب لفك الكريات قبل التهجين. باستخدام قطارة ، أضف ملليلترا واحدا من البولي إيثيلين جلايكول 1500 تم تسخينه مسبقا إلى 37 درجة مئوية بالتنقيط إلى حبيبات الخلية المفكوكة على مدار 45 ثانية أثناء تدوير الجزء السفلي من الأنبوب برفق. ثم أضف ببطء ملليلترا واحدا من DMEM المسخن مسبقا إلى 37 درجة مئوية إلى الخليط لمدة 90 ثانية ، متبوعا ب 30 ملليلترا أخرى من DMEM الطازج وضع أنبوب الانصهار في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.

بعد الحضانة ، حصاد الخلايا. أعد تعليق وسط HAT والثقافة في صفيحة 96 بئرا ملقحة بالبلاعم البريتونية. بعد خمسة أيام ، أضف 100 ميكرولتر من وسيط HAT الطازج إلى كل بئر.

ومرة أخرى بعد خمسة أيام من الحضانة ، استبدل الوسيط بوسط HAT. استخدم صفيحة عيار ميكرو مغلفة بخمسة ميكروغرام لكل مليلتر من بروتين APN المخفف في 0.05 مولار PBS لتحليل الأجسام المضادة وحيدة النسيلة في طاف الأورام الهجينة باستخدام مقايسة ELISA. تنمو pET28a بالإضافة إلى الأجسام المضادة المؤتلفة aminopeptidase NBL21 البكتيريا المحولة في وجود 0.4 مليمولار بيتا D-1-ثيوغالاكتوبيرانوسيد في شاكر مداري عند 37 درجة مئوية لمدة 10 ساعات.

بذرة 100 ميكرولتر 0.5 مرة 10 إلى خلايا مبيض الهامستر الصيني الخامس لكل بئر في صفيحة 96 بئرا للحضانة عند 37 درجة مئوية وجو من ثاني أكسيد الكربون بنسبة 6٪ لمدة 18 إلى 24 ساعة. عندما تصل الخلايا إلى التقاء 80 إلى 90٪ ، قم بتخفيف pIRES2-zs Green واحد الأجسام المضادة المؤتلفة أمينوببتيداز والبلازميد مع Opti-MEM إلى تركيز نهائي قدره 0.1 ميكروغرام لكل ميكرولتر. بعد خمس دقائق ، امزج 50 ميكرولترا من pIRES2-zs Green Green الأجسام المضادة المؤتلفة أمينوببتيداز والبلازميد مع ميكرولتر واحد من ليبوفيكتامين 2000 و 49 ميكرولتر من Opti-MEM.

بعد 20 دقيقة من الحضانة ، أضف 100 ميكرولتر من الخليط إلى كل بئر من صفيحة 96 بئرا تحتوي على خلايا CHO. في أربع إلى ست ساعات بعد النقل ، استبدل الوسيط ب DMEM F12 المكمل ب 10٪ FBS. بعد 48 ساعة من الحضانة ، أضف 400 ميكروغرام لكل ميكرولتر G418 إلى كل بئر لتحديد الخلايا المنقولة بثبات.

بعد 10 أيام من الاختيار باستخدام وسيط DMEM F12 المكمل ب 10٪ FBS و 400 ميكروغرام لكل ميكرولتر G418 ، قم بفرز الخلايا باستخدام فرز الخلايا المنشط بالفلورة. تمييع متسلسلا الخلايا الإيجابية المحصودة. قم بزرعها بمعدل 0.5 إلى 2 خلية لكل بئر في صفيحة 96 بئرا واستزراعها في 37 درجة مئوية ، 6٪ حاضنة ثاني أكسيد الكربون.

في التحليل المجهري التمثيلي ، ظهرت جميع خلايا الأورام الهجينة مستديرة ومشرقة وواضحة. تم تأكيد الأجسام المضادة وحيدة النسيلة المنقاة التي تحتوي على سلاسل ثقيلة 50 كيلو دالتون و 25 كيلودالتون خفيفة بواسطة SDS-PAGE وتم العثور عليها في الاستسقاء المنقى. يتم عرض عيارات هذه الأجسام المضادة أحادية النسيلة المضادة ل APN في طافات الثقافة والاستسقاء هنا.

كشف التنميط المتماثل للأجسام المضادة أحادية النسيلة للفأر أن الأجسام المضادة المشتقة من الحيوانات المستنسخة 5B31 و 5B36 و 3C48 و 5C51 و 6C56 تمتلك فئات فرعية من الغلوبولين المناعي G2B بينما كان APN 2A20 عبارة عن جسم مضاد من نوع الغلوبولين المناعي G2A kappa والجسم المضاد أحادي النسيلة APN 3FD9 و 3F10 و 10F3 ينتمي إلى نوع الغلوبولين المناعي M وسلاسل ضوء كابا المعالجة. أظهرت معظم هذه الأجسام المضادة وحيدة النسيلة قيم AV تزيد عن 50٪ مما يشير إلى أنها استهدفت حوائط مختلفة في APN بينما تعرف الجسم المضاد APN 5C51 على حوامل مستضدية مثل تلك التي تعرفت عليها الأجسام المضادة أحادية النسيلة APN 3C48 و 5B31 و 6C56. تم ربط جين APN 5B36 VHVL المضخم في ناقل واحد pET28a إيجابي أو pIRES2-zs Green لبناء بلازميدات التعبير المؤتلف pET28a إيجابية RABS APN و pIRES2-zs Green one RABS APN على التوالي.

تم تنقية وتحليل الأجسام المضادة التي تم التعبير عنها بواسطة كل من pET28a بالإضافة إلى الأجسام المضادة المؤتلفة aminopeptidase NBL21 و pIRES2-zs Green one الأجسام المضادة المؤتلفة خلايا أمينوببتيداز NCHO باستخدام فحوصات ELISA و IFA. ومع ذلك ، فإن الجسم المضاد المعبر عنه فقط في طاف pIRES2-zs Green واحد الأجسام المضادة المؤتلفة خلايا أمينوببتيداز NCHO تتعرف على بروتين APN. وصل ارتباط الأجسام المضادة أحادية النسيلة APN 5B36 ببروتينات APN إلى توازن أبكر من الأجسام المضادة المؤتلفة.

تنقية الأجسام المضادة وحيدة النسيلة في طاف باستخدام بروتين أغاروز أفضل من استخدام ترسيب كبريتات الأمونيا المشبعة.