Name: تصوير الخلايا الحية للنشاط النسخي في فواصل الحمض النووي مزدوجة ستراند (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 7 s
Description: اكتشف طريقة تصوير الخلايا الحية لرصد النشاط النسخي عند فواصل الحمض النووي مزدوجة السلسلة باستخدام مجهر الفلورة. تتيح هذه التقنية مراقبة جزيئات الرنا الفردية بدقة زمنية تصل إلى ثوانٍ لفهم استجابة الخلايا للضرر الجيني.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

نشكر RH Singer، J.A. Chao، T. Misteli، M. كارمو فونسيكا لهدايا من البلازميدات والكواشف. ونحن مدينون أيضا لموظفي مرفق التصوير الحيوي التابع ل iMM، أ. تيمودو، أ. ناسيمنتو، وجي رينو، بقراءة المخطوطة بشكل نقدي. تم تمويل هذا العمل من قبل PTDC/MED-OUT/32271/2017، PTDC/BIA-MOL/30438/2017 وPTDC/MED-OUT/4301/2020 من فونداساو بارا A Ciência e a Tecnologia (FCT)، البرتغال ومن LISBOA-01-0145-FEDER-007391، مشروع بتمويل مشترك من فيدر من خلال بور ليسبوا، البرتغال 2020-Programa الأوبرالية الإقليمية دي لشبونة، وFCT. كما تم تلقي التمويل من برنامج الاتحاد الأوروبي للأبحاث والابتكار (RiboMed 857119). حاصل على زمالة دكتوراه FCT 2020.05899.BD.

<ol><li>Jackson, S. P., Bartek, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+DNA-damage+response+in+human+biology+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The DNA-damage response in human biology and disease.</a> Nature. 461 (7267), 1071-1078 (2009).</li>
<li>Capozzo, I., Iannelli, F., Francia, S., d'Adda di Fagagna, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Express+or+repress%3F+The+transcriptional+dilemma+of+damaged+chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Journal%22%5BJournal%5D)">Express or repress? The transcriptional dilemma of damaged chromatin.</a> FEBS Journal. 284 (14), 2133-2147 (2017).</li>
<li>Michelini, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Damage-induced+lncRNAs+control+the+DNA+damage+response+through+interaction+with+DDRNAs+at+individual+double-strand+breaks%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Damage-induced lncRNAs control the DNA damage response through interaction with DDRNAs at individual double-strand breaks.</a> Nature Cell Biology. 19 (12), 1400-1411 (2017).</li>
<li>Vítor, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+imaging+of+transcription+at+damaged+chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Single-molecule imaging of transcription at damaged chromatin.</a> Science Advances. 5 (1), (2019).</li>
<li>Michalik, K. M., Böttcher, R., Förstemann, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+RNA+response+at+DNA+ends+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Small RNA response at DNA ends in Drosophila.</a> Nucleic Acids Research. 40 (19), 9596-9603 (2012).</li>
<li>Wei, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+small+RNAs+in+DNA+double-strand+break+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A role for small RNAs in DNA double-strand break repair.</a> Cell. 149 (1), 101-112 (2012).</li>
<li>Francia, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-specific+DICER+and+DROSHA+RNA+products+control+the+DNA-damage+response%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Site-specific DICER and DROSHA RNA products control the DNA-damage response.</a> Nature. 488 (7410), 231-235 (2012).</li>
<li>Vítor, A. C., Huertas, P., Legube, G., de Almeida, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+DNA+double-strand+break+repair%3A+An+ever-growing+toolbox%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Biosciences%22%5BJournal%5D)">Studying DNA double-strand break repair: An ever-growing toolbox.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 24(2020).</li>
<li>Alt, F. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+secreted+and+membrane-bound+immunoglobulin+mu+heavy+chains+is+directed+by+mRNAs+that+differ+at+their+3%27+ends%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Synthesis of secreted and membrane-bound immunoglobulin mu heavy chains is directed by mRNAs that differ at their 3' ends.</a> Cell. 20 (2), 293-301 (1980).</li>
<li>Watakabe, A., Tanaka, K., Shimura, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+exon+sequences+in+splice+site+selection%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">The role of exon sequences in splice site selection.</a> Genes & Development. 7 (3), 407-418 (1993).</li>
<li>Guth, S., Martínez, C., Gaur, R. K., Valcárcel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+substrate-specific+requirement+of+the+splicing+factor+U2AF%2835%29+and+for+its+function+after+polypyrimidine+tract+recognition+by+U2AF%2865%29%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Evidence for substrate-specific requirement of the splicing factor U2AF(35) and for its function after polypyrimidine tract recognition by U2AF(65).</a> Molecular and Cellular Biology. 19 (12), 8263-8271 (1999).</li>
<li>Martin, R. M., Rino, J., Carvalho, C., Kirchhausen, T., Carmo-Fonseca, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-cell+visualization+of+pre-mRNA+splicing+with+single-molecule+sensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Live-cell visualization of pre-mRNA splicing with single-molecule sensitivity.</a> Cell Reports. 4 (6), 1144-1155 (2013).</li>
<li>Peabody, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RNA+binding+site+of+bacteriophage+MS2+coat+protein%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">The RNA binding site of bacteriophage MS2 coat protein.</a> The EMBO Journal. 12 (2), 595-600 (1993).</li>
<li>Lim, F., Peabody, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+recognition+site+of+PP7+coat+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">RNA recognition site of PP7 coat protein.</a> Nucleic Acids Research. 30 (19), 4138-4144 (2002).</li>
<li>Chao, J. A., Patskovsky, Y., Almo, S. C., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+the+coevolution+of+a+viral+RNA-protein+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Structural basis for the coevolution of a viral RNA-protein complex.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 15 (1), 103-105 (2008).</li>
<li>Bertrand, E., Chartrand, P., Schaefer, M., Shenoy, S. M., Singer, R. H., Long, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+ASH1+mRNA+particles+in+living+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Localization of ASH1 mRNA particles in living yeast.</a> Molecular Cell. 2 (4), 437-445 (1998).</li>
<li>Larson, D. R., Zenklusen, D., Wu, B., Chao, J. A., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+observation+of+transcription+initiation+and+elongation+on+an+endogenous+yeast+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Real-time observation of transcription initiation and elongation on an endogenous yeast gene.</a> Science. 332 (6028), 475-478 (2011).</li>
<li>Soutoglou, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Positional+stability+of+single+double-strand+breaks+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Positional stability of single double-strand breaks in mammalian cells.</a> Nature Cell Biology. 9 (6), 675-682 (2007).</li>
<li>Rouet, P., Smih, F., Jasin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Introduction+of+double-strand+breaks+into+the+genome+of+mouse+cells+by+expression+of+a+rare-cutting+endonuclease%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Introduction of double-strand breaks into the genome of mouse cells by expression of a rare-cutting endonuclease.</a> Molecular and Cellular Biology. 14 (12), 8096(1994).</li>
<li>Roukos, V., Voss, T. C., Schmidt, C. K., Lee, S., Wangsa, D., Misteli, T. Spatial Dynamics of Chromosome Translocations in Living Cells. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRoukos%2C+V+%22Science%22">Science</a>. 341 (6146), New York, N.Y. 660(2013).</li>
<li>Rino, J., de Jesus, A. C., Carmo-Fonseca, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STaQTool%3A+Spot+tracking+and+quantification+tool+for+monitoring+splicing+of+single+pre-mRNA+molecules+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">STaQTool: Spot tracking and quantification tool for monitoring splicing of single pre-mRNA molecules in living cells.</a> Methods. 98, 143-149 (2016).</li>
<li>Hamperl, S., Bocek, M. J., Saldivar, J. C., Swigut, T., Cimprich, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription-replication+conflict+orientation+modulates+R-Loop+levels+and+activates+distinct+DNA+damage+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Transcription-replication conflict orientation modulates R-Loop levels and activates distinct DNA damage responses.</a> Cell. 170 (4), 774-786 (2017).</li>
<li>D'Alessandro, G., d'Adda di Fagagna, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+and+DNA+Damage%3A+Holding+Hands+or+Crossing+Swords%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Transcription and DNA Damage: Holding Hands or Crossing Swords.</a> Journal of Molecular Biology. 429 (21), 3215-3229 (2017).</li>
<li>Boulant, S., Kural, C., Zeeh, J. C., Ubelmann, F., Kirchhausen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+dynamics+counteract+membrane+tension+during+clathrin-mediated+endocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Actin dynamics counteract membrane tension during clathrin-mediated endocytosis.</a> Nature Cell Biology. 13 (9), 1124-1131 (2011).</li>
</ol>

ولا يوجد لدى صاحبي البلاغ تضارب في المصالح يكشفان عنه.

وقد تم تحديد الصراعات بين العمليات البيولوجية الأساسية مثل النسخ المتماثل والنسخ وتلف الحمض النووي وإصلاح الحمض النووي كمصدر حاسم لعدم استقرار الجينوم22. وقد أدت هذه الدراسات أيضا إلى اكتشاف النسخ في مواقع تلف الحمض النووي وعزت دورا وظيفيا إلى النصوص الناجمة عن الكسر في تنظيم عمليات إصلاح تلف الحمض النووي23. تسمح الأدوات الجديدة والبروتوكول الموصوف هنا بإجراء مزيد من التحقيق في ديناميكيات نسخ الحمض النووي الريبي Pol II في DSBs. ومن النقاط الحاسمة في هذا البروتوكول توليد خطوط الخلايا التي تحتوي على نسخة واحدة من جين المراسل المدمج في الجينوم. هذه الميزة الرئيسية يزيل الضوضاء الناجمة عن نسخ العديد من الجينات مراسل متكاملة مع نسخ متعددة داخل مكان الجينوم واحد ويسمح بجمع المعلمات الحركية من ديناميات النسخ والنصوص الحمض النووي الريبي الفردية. ومن المتطلبات التقنية الحاسمة لمراقبة نسخ التكامل الجيني لمراسل واحد هو توافر نظام المجهر الذي يسمح بالكشف عن نصوص الحمض النووي الريبي المفرد المسمى بنظام MS2 أو PP7 في الخلايا الحية4,12. هنا، يتم إجراء المجهر الحي الخلية على نظام قرص الغزل Confocal محمولة على المجهر مقلوب، ومجهزة 100 كيلوواط ليزر الحالة الصلبة إلى جانب مرشح الصوتية البصرية غير قادر على النحو المبين في مكان آخر24. وعلاوة على ذلك، لدراسة النسخ في DSB واحد باستخدام المراسلين، يجب مراقبة الخلايا الفردية بعناية لتحقيق أعلى دقة الوقت، الأمر الذي يتطلب خلايا التصوير لعدة ساعات، مما يجعل هذا المقايسة الإنتاجية منخفضة. ومع ذلك ، نلاحظ العديد من الخلايا بالتوازي مع تحديد المواقع التي تسيطر عليها مرحلة المجهر التي تحركها بيزو. لضمان الظروف البيئية المثلى لمراقبة الخلايا الحية على مدى ساعات، يتم وضع جسم المجهر، بما في ذلك مرحلة العينة، داخل غرفة بيئية زجاجية. بالإضافة إلى ذلك ، يتم تركيب غرفة حضانة مرحلة مغلقة على مرحلة المجهر وتوصيلها بوحدات التحكم في إمدادات ثاني أكسيد الكربون والرطوبة.
الخطوة الحاسمة الأولى في البروتوكول هي اختيار المناطق ذات الاهتمام مع الخلايا للتصوير. يجب أن يحتوي كل موضع XY الذي تم وضع علامة عليه للتصوير على خلية واحدة أو أكثر تظهر العدوى مع بروتينات الربط الحلقي الجذعية الحمض النووي الريبي الفلوري وفقا لمخطط الجينات والإصابة بالمراسل الموصوف في القسم 1 ، الجدول 1 ، وكذلك في الشكل 2D ، E. وعلاوة على ذلك، يجب أن تظهر الخلايا مواقع النسخ المسماة مشرق يجب أن تكون مشتركة مع بناء I-SceI-GR-iRFP713، ويجب أن يتم توطين البروتين في البداية في السيتوبلازم (الشكل 2D و E).
يجب أن تظهر الخلايا مستوى كثافة مضان من MS2 الموسومة بالفلورسنت غير المنضم و / أو بروتين معطف PP7 منخفض بما يكفي للكشف عن النصوص ذات العلامات المفردة على مستوى الفلورية الخلفية. وفي الوقت نفسه، من الضروري وجود مستوى قوي من كثافة الفلورسنت لبروتينات معطف MS2 و/أو PP7 الموسومة بفلورسنت للسماح بالتصوير على مدى 60 دقيقة على الأقل دون فقدان الكثير من الفلورسنت بسبب بعض التبييض الذي يحدث. يتم استخدام "عرض صورة المقياس" مع نطاق ثابت كما هو موضح في القسم 3.7 للسماح باختيار موحد للخلايا وفقا لمستوى كثافة الفلورسينس.
خطوة البروتوكول الحرجة الثانية هي إضافة TA إلى الخلايا على مواقع XY المحددة مسبقا من خلال ثقب صغير في غطاء طبق القاع الزجاجي. أي تلاعب في طبق أسفل الزجاج من شأنه أن يسبب تحولا من موقف XY ملحوظ من الخلايا ويجب تجنبها. لذلك ، فإن التعامل بعناية مع micropipette مع إضافة TA المخفف في وسيط النمو الخلوي أمر حيوي لمراقبة ناجحة للخلايا المختارة مسبقا ، كما هو موضح في الشكل 2F. وسيتطلب تكييف نظم مختلفة لإضافة أدوية إلى الخلايا المثبتة على مرحلة المجهر، مثل نظام التشوه، غرفة حضانة مرحلة منفصلة مع فتحات مدخل أنبوب وخروج ومضخة أو نظام حقن لإدارة المخدرات. وتؤدي طرق أخرى مثل شرائح القناة ذات الأسطح السفلية الشبيهة بالأغطية إلى الانتشار البطيء للأدوية الخاضعة للإدارة في القناة وتسبب تأخيرا إضافيا بين إضافة الأدوية وتأثيرها. وأخيرا، قد يؤدي الأنابيب غير الحذرة إلى فتح شريحة قناة إلى تغيير موضع العينة أيضا. لذلك ، فإن النظام الحالي مع ثقب حفر مخصص في غطاء طبق زجاجي القاع واضح للتكيف ، ومنخفض التكلفة ، ومناسب لإدارة وسائل الإعلام المختلفة للنمو والأدوية والمكونات. القطر الصغير للثقب والغلاف الجوي المرطب في غرفة حضانة المرحلة يمنع أيضا الجفاف من وسط الخلية.
والخطوة الحاسمة الثالثة في هذا البروتوكول هي تحليل البيانات، الذي يتطلب تفتيشا يدويا للنقاط الزمنية التي يتوقف فيها النسخ بسبب تحريض جهاز DSB. يشار إلى النقطة الزمنية لإنهاء النسخ من خلال إصدار النصوص الأخيرة من الموقع المسمى سابقا مشرق من النسخ الجيني المراسل. وبالمثل، يجب فحص أحداث بدء النسخ الناجم عن الكسر بعناية للكشف عن أحداث النسخ الفردية مع نسبة الإشارة إلى الضوضاء المنخفضة نسبيا من الرنانات المفردة المسماة بالفلورسنت.
وتضيف ديناميات إصلاح ال DSB المستحث طبقة إضافية من التعقيد إلى تحليلات البيانات المتولدة باستخدام هؤلاء المراسلين، مما يحد منها بالدقائق الأولى مباشرة بعد تحريض DSB. قد تجمع الطبيعة المعدلة وراثيا لجينات المراسل والطبيعة الغنية المتكررة للصفائف الحلقية الجذعية MS2 و PP7 مشهدا فريدا من الكروماتين ، مما يتعارض مع إنشاء برامج نسخ مستقرة مفترضة ناتجة عن الكسر. ومع ذلك ، بالمقارنة مع التأين - أو الأشعة فوق البنفسجية ، وI - SceI بوساطة التعريفي من DSB في الجينات مراسل هو نظام أكثر قوة للتحقيق في النسخ في DSBs الفردية.
يمكن الجمع بين أنظمة الإندونوكليز المختلفة مثل I-CreI أو I-PpoI أو AsiSI التي لديها أو ليس لديها مواقع اعتراف إضافية داخل الجينوم البشري مع أنظمة الجينات المراسلة الحالية لتحقيق كفاءة أعلى محتملة لتوليد DSBs. ومع ذلك ، فإنها تتطلب أولا إدخال موقع التعرف على الإندونوكليا في جينات المراسل. ثانيا، قد يكون لديهم تباين مماثل في توقيت وكفاءة التعريفي من DSB في الخلايا الفردية. من ناحية أخرى، قد يؤدي إدخال نسخ مترادفة من مواقع التعرف على الإندونوكلياز إلى زيادة كفاءة تحريض DSB. وعلاوة على ذلك، فإن اختبار أنظمة الجينات المراسل المعروضة في خطوط الخلايا المختلفة من شأنه أن يسمح بالمقارنة بين ديناميات النسخ في مواقع DSB بين الخلفيات الخلوية المختلفة وتوافر مسارات مختلفة لإصلاح تلف الحمض النووي كما هو الحال في الخلايا السرطانية والخلايا الأولية والخلايا غير الدراجاتية المتباينة. ومع ذلك ، فإن بناء الجينات مراسل لتكون متوافقة مع نظام Flp / FRT حاليا الحد من الاندماج في خطوط الخلية المضيفة Flp / FRT المتاحة.
بالإضافة إلى التطبيقات المستندة إلى المجهر ، يمكن أيضا دمج جينات المراسل الحالي مع المقايسات الكيميائية الحيوية ، مثل التحلل المناعي للكروماتين ، لدراسة توظيف عوامل إصلاح الحمض النووي أو النسخ إلى DSB واحد أو لتقييم إشغال النيوكليوسوم ، وتعديلات الهستون ، وحالة الكروماتين حول موقع DSB. وعلاوة على ذلك، فإن الجمع مع نظم المراسلات المختلفة من شأنه أن يسمح بدراسة الروابط الوظيفية بين تلف الحمض النووي وعمليات مثل تنظيم الجينوم أو تكرار الحمض النووي.

فواصل حبلا مزدوجة الحمض النووي (DSBs) هي آفات الحمض النووي السامة التي تعطل وظيفة الخلية وتساهم في تمرد العديد من الأمراض والشيخوخة1. الطفرات الناتجة عن إصلاح غير دقيق للDSBs تؤثر على التعبير الجيني ووضع الأساس للانخفاض الوظيفي للخلية. ويشير الرأي الناشئ بأن مركبات DSBs تقود النسخ الناجم عن كسر نوفو في موقع الآفة2،3،4،5،6،7 إلى أن DSBs قد تؤثر أيضا على الوظيفة الخلوية من خلال الرنانات الناجمة عن الكسر. وتشير عدة دراسات حديثة إلى أن مركبات ثنائي الفينيل متعددة المستويات كافية لبدء النسخ المبرمج (على سبيل المثال، في الجينات غير القابلة للانزكزاز) والنسخ غير المجدول (على سبيل المثال، لدى المروجين غير الكنسيين)4,5,7. ومع ذلك ، على الرغم من العديد من الدراسات التي تستكشف الروابط بين تلف الحمض النووي والنسخ ، لا يزال الحقل متخلفا في قدرته على تقديم توصيف دقيق (أي جزيء واحد) للأحداث النسخية في مواقع كسر الحمض النووي. وكان أحد الأسباب الهامة لذلك هو عدم وجود أدوات تجريبية مناسبة. إن تشعيع الخلايا (أشعة γ، والأشعة السينية، والأيونات الثقيلة)، والعلاجات الدوائية (مثل مثبطات توبويسوميراز أو عوامل التوليل) تفتقر إلى الدقة المكانية وتحفز آفات الحمض النووي غير مركبات ثنائي الفينيل متعددة الخلايا، بما في ذلك فواصل الخيط الواحد ووكلاء الحمض النووي8. تولد الخلايا الإندونوكلية، مثل I-PpoI و AsiSI، DSBs خاصة بالجراد ولكن لم يتم دمجها مع نظام يسمح بالتصور المتزامن للخلايا الحية للنسخ في مكان واحد بدقة زمنية عالية8. لتجاوز هذا القيد، قاد مختبرنا تطوير مجموعة من المراسلين المتطورين الذين يتصورون النسخ مباشرة بدقة جزيء واحد عند الحث الخاضع للرقابة ل DSB4 فريدة من نوعها. هنا، نصف هؤلاء المراسلين، ونقدم بروتوكولا مفصلا لتصوير النسخ بالخلايا الحية في DSBs ونعرض البيانات التي تكشف عن بدء النسخ في DSB واحد.
تستند أنظمة الجينات المراسل المستخدمة في هذا البروتوكول على الجين مراسل IgM الماوس تتميز جيدا وتحتوي على exons M1 و M2 من شكل غشاء ملزمة (μm) من IgM μ سلسلة ثقيلة9,10,11. فصل intron الهجين exons اثنين مع نص قوي adenovirus الرئيسية في وقت متأخر (AdML) PY tract12. يتم التحكم في التعبير عن جينات المراسل من قبل مروج الفيروس المضخم للخلايا البشري (CMV) ، حيث تم إدخال نسختين مترادفتين من تسلسل مشغل تيت (TetO). يتم إدخال جينات المراسل في ناقل بلازميد يحتوي على موقع هدف إعادة دمج Flp (FRT) وإدراجها في موقع مستهدف محدد ل FRT في جينوم خط الخلية المضيف HEK293. هذا الخط الخلية يعبر أيضا بشكل تأسيسي البروتين قمع تيت لتنظيم التعبير عن الجين مراسل عن طريق وجود أو عدم وجود التتراسيكلين / دوكسيسيكلين. وللسماح بتصور النسخ الجيني للمراسل، تم إدراج 24 تكرارا مترادفا لتسلسل الحلقة الجذعية MS2 و24 تكرارا مترادفا لتسلسل الحلقة الجذعية PP7 في مواقع مختلفة فيما يتعلق بموقع بدء النسخ وهيكل exon/intron لجين المراسل. تتشكل الحلقات الجذعية من MS2/PP7 RNA عند النسخ وترتبط على وجه التحديد ببروتينات معطف MS2/PP7 المعبر عنها خارج الرحم الموسومة بالبروتينات الفلورية الخضراء والحمراء ، وهي استراتيجية تستخدم على نطاق واسع من قبل لتصوير النسخ13،14،15. بالإضافة إلى ذلك، تم إدراج نسخة واحدة من تسلسل التعرف على 18 bp لedonuclease توجيه I-SceI التي تحيط بها مباشرة صفائف تسلسل حلقة الجذعية الحمض النووي الريبي في الجينات مراسل. واستخدمت تقنيات الاستنساخ القياسية لتوليد جميع البلازميدات، وتم توليف الجزء الذي يحتوي على حلقة الجذعية I-SceI-24xMS2 من جين مراسل PROP بواسطة خدمة توليف الجينات التجارية.
تم بناء الجين مراسل DSB المروج القريبة (PROP) عن طريق إدراج موقع القطع I-SceI 45 أزواج قاعدة (bp) المصب من موقع بدء النسخ المفترض في exon I، تليها 149 bp حتى بداية كاسيت حلقة الجذعية MS2 24x، الذي تم تصميمه دي نوفو مع اثنين من تسلسل حلقة الجذعية غير متطابقة بالتناوب16 وخمسة إضافية غير المتكررة 20 بت تسلسل المسافة للحد من التكرار. يتبع صفيف حلقة الجذعية MS2 72 نقطة أساس حتى بداية intron 1844 bp و 1085 bp exon II حتى موقع الانقسام والتعددية. يقوم exon II بترميز بروتين فلوري سماوي (CFP) منصهر في تسلسل استهداف بيروكسيسومال C-terminal (PTS) من أوكسيداز أسيل بيروسومال الإنسان للسماح بفحص مستقل للتعبير الجيني للمراسل (الشكل 1A).
الجين مراسل EXON II DSB (EX2) يتكون من exon 167 bp أنا تليها intron و exon II ترميز CFP-PTS. وفي اتجاه مجرى النهر على مسافة 169 نقطة أساس، تم إدخال كاسيت يحتوي على حلقات جذعية 24x MS2، يليه تسلسل وصلة 84 نقطة أساس مع موقع I-SceI في الوسط، يليه حلقات جذعية 24x PP7 و221 نقطة أساس حتى موقع الانقسام والتعددية 17 (الشكل 1B).
وأخيرا ، فإن الجين مراسل EXON II DSB مع وضع العلامات النسخ المضادة (EX2AS) يستند إلى نص الجين UBB-201 في كل مكان B (UBB) البشري ويحتوي على اثنين من exons وintron واحد. exon لدي طول إجمالي قدره 1534 نقطة أساس مع إدراج عكسي من 24x MS2 الجذعية حلقة التسلسل. لذلك ، سيتم نسخ تسلسل الحمض النووي الريبي الصحيح MS2 stem-loop في اتجاه مضاد فيما يتعلق بالنسخ المنطقي لجين المراسل من مروج CMV. يبلغ طول الإنترون 490 نقطة أساس، يليه exon II مع موقع I-SceI ، وتم إدراج منطقة ترميز لوحدات فرعية في كل مكان داخل الإطار. المصب من الجين UBB هو التسلسل الذي يشكل 24x PP7 الجذعية حلقة عند نسخ الجين مراسل في اتجاه المعنى (الشكل 1C).
يسمح التحويل العابر للبناء غير القابل للاختزال ل I-SceI بالتحكم في إنشاء DSB في موقع التعرف المدرج داخل كل جين مراسل18. يتم دمج الإندونوكليز I-SceI في الإطار مع المجال الملزم لليجند لمستقبلات الجلوكوكورتيكويد وبروتين فلوري أحمر بعيد iRFP713. هذا البناء هو السيتوبلازمية في غياب الأسيتونيد تريامسينولون (TA) ولكن يهاجر بسرعة إلى النواة عند إضافة TA إلى متوسط النمو للخلايا (الشكل 1D). إن تحريض DSBs من قبل نظام I-SceI قوي ، كما هو موضح قبل 18،19،20. ويمكن رصد النسخ الجيني للمراسل بالتوازي من خلال تصور أنظمة الحمض النووي الريبي الموسومة بالفلورسنت MS2 و PP7.

<table><tbody><tr><td>100 ميجاوات ليزر الحالة الصلبة</td><td>متماسكة ، سانتا كلارا ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية</td><td></td><td></td></tr><tr><td>3i Marianas SDC نظام قرص الغزل</td><td>متحد البؤر Intelligent Imaging Innovations Inc.</td><td></td><td></td></tr> كاميرا <tr><td>EMCCD المبردة بالهواء Evolve 512</td><td>Photometrics ، توكسون ، أريزونا الولايات المتحدة الأمريكية</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Axio Observer Z1 المجهر المقلوب</td><td>Carl Zeiss MicroImaging ، ألمانيا</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Blasticidin</td><td>InvivoGen</td><td>ant-bl-1</td><td></td></tr><tr><td>مصل الأبقار الجنيني المجرد</td><td>من الفحم Sigma-Aldrich</td><td>F6765-500 ML</td><td></td></tr><tr><td>CO2 module S</td><td>PeCon GmbH ، Erbach ، ألمانيا</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CSU-X1 وحدة قرص الغزل متحد البؤر</td><td>Yokogawa Electric ، طوكيو ، اليابان</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>41966029</td><td></td></tr><tr><td>DMEM مع Hepes no PhenolRed</td><td>Gibco</td><td>21063-029</td><td></td></tr><tr><td>Doxicyclin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9891</td><td>لتحريض التعبير الجيني للمراسل ؛ تم استخدام محلول مخزون 0.5 مجم / مل عند 1: 1000 تخفيف في نمو الخلية المتوسطة</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>10270106</td><td></td></tr><tr><td>Flp-In T-REx 293 خط الخلية</td><td>Thermo Fischer Scientific Invitrogen</td><td>R75007</td><td></td></tr><tr><td>I-SceI-24x MS2 تسلسل الحلقة الجذعية</td><td>GeneArt ، Thermo Fischer Scientific</td><td></td><td>مخصص جزء من الحمض النووي الذي يحتوي على تسلسل التعرف على I-SceI واحد و 24 تسلسل حلقة جذعية ترادفية MS2</td></tr><tr><td>جهاز التسخين الرطوبة 2000</td><td>PeCon GmbH ، Erbach ، ألمانيا</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hygromycin B</td><td>Roche</td><td>10843555001</td><td></td></tr><tr><td>Immersion Oil Immersol 518 F</td><td>Carl Zeiss MicroImaging Inc.)</td><td>444960-0000-000</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamin 3000 كاشف مساعد P3000</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>L3000001</td><td>كاشف مساعد</td></tr><tr><td>التعداء كاشف Lipofectamine 3000 كاشف</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>L3000001</td><td>كاشف التعداء القائم على الدهون</td></tr><tr><td>MatTek طبق 35 مم ، قاع زجاجي رقم 1.5</td><td>MatTek شركة ، آشلاند ، ماساتشوستس ، الولايات المتحدة الأمريكية</td><td>P35G-1.5-10-C</td><td></td></tr><tr><td>غرفة حضانة المجهر</td><td>PeCon GmbH ، Erbach ، ألمانيا</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pcDNA5 / FRT / TO</td><td>Thermo Fischer Scientific Invitrogen</td><td>V652020</td><td></td></tr><tr><td>pOG44 البلازميد</td><td>Thermo Fischer Scientific Invitrogen</td><td>V600520</td><td></td></tr><tr><td>SlideBook 6.0 Software</td><td>Intelligent Imaging Innovations Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>غرفة حضانة المسرح PeCon P-Set 2000</td><td>PeCon GmbH ، Erbach ، ألمانيا</td><td></td><td></td></tr><tr><td>StaQtool Software</td><td>iMM-JLA لشبونة ، البرتغال</td><td></td><td>متوفر في: https://imm.medicina.ulisboa.pt/facility/bioimaging/lib/exe/fetch.php?media=STaQTool_setup.zip</td></tr><tr><td>تريامسينولون أسيتونيد (TA)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>T6501</td><td>الجلوكوكورتيكويد الاصطناعية يحفز مستقبل الجلوكوكورتيكويد على الهجرة من السيتوبلازم إلى النواة</td></tr><tr><td>محلول التربسين / EDTA (TE) R001100</td><td></td><td></td> <td>ثيرمو فيشر العلمي</td></tr></tbody></table>

تصوير الخلايا الحية للنشاط النسخي في فواصل الحمض النووي مزدوجة ستراند

Live-Cell Imaging of Transcriptional Activity at DNA Double-Strand Breaks

فواصل حبلا مزدوجة الحمض النووي (DSB) هي النوع الأكثر حدة من تلف الحمض النووي. على الرغم من العواقب الكارثية على سلامة الجينوم ، فإنه لا يزال بعيد المنال حتى الآن كيف تؤثر DSBs على النسخ. وكان السبب في ذلك هو عدم وجود أدوات مناسبة لرصد النسخ في وقت واحد وتحريض DSB genic مع دقة زمنية ومكانية كافية. يصف هذا العمل مجموعة من المراسلين الجدد الذين يتصورون النسخ مباشرة في الخلايا الحية مباشرة بعد تحريض DSB في قالب الحمض النووي. وتستخدم البكتيريا الحمض النووي الريبي الجذعية الحلقات لرصد النسخ مع حساسية جزيء واحد. لاستهداف DSB إلى منطقة جين محددة ، تم تصميم جينات المراسل لاحتواء تسلسل اعتراف واحد من الإندونوكلياز I-SceI ، غائبة عن الجينوم البشري. تم دمج نسخة واحدة من كل جين مراسل في جينوم خطوط الخلايا البشرية. يسمح هذا النظام التجريبي بالكشف عن جزيئات الحمض النووي الريبي المفردة الناتجة عن النسخ الجيني الكنسي أو عن طريق بدء النسخ الناجم عن كسر الحمض النووي. يوفر هؤلاء المراسلون فرصة غير مسبوقة لتفسير التفاعلات المتبادلة بين النسخ وتلف الحمض النووي والكشف عن جوانب غير مقدرة حتى الآن من النسخ الناجم عن كسر الحمض النووي.

تسمح خطوط الخلية التي تؤوي جينات المراسل الموصوفة في الشكل 1A-C بدراسة ديناميكيات النسخ في DSB واحد في الخلايا الحية. تشير الأرقام في الشكل 1A-C أسفل كل تمثيل جيني مراسل رسومي إلى الطول في أزواج الكيلوبيس (kbp). تشير CMV إلى أن مروج الفيروس المضخم للخلايا ، TetO هو تسلسل مشغل Tet ، ويسلط pA الضوء على موقع الانقسام وتعدد الأدينيل 3 في نهاية الجين. CFP-PTS هو بروتين فلوري سماوي مشفر منصهر في إشارة استهداف بيروكسيسومال ، و2UBB هي وحدة الترادف البشري المشفرة في كل مكان B. باتباع البروتوكول وإجراءات التحليل الموضحة أعلاه، يمكن الحصول على رسوم بيانية تعرض عدد النصوص الجينية للمراسلات ذات العلامات الفلورية بمرور الوقت، مع دقة زمنية لثوان على فترات تصل إلى ساعات (الشكل 4A-D). يعرض الرسم البياني في الشكل 4A المسار الزمني لقيم TFI لموقع نسخ الجينات لمراسل PROM المسمى بتراكم جزيئات MS2-GFP على النصوص الوليدة. يمثل هذا الرسم البياني الخاص تجربة تحكم بدون إضافة TA؛ لذلك، يتم حث أي DSB. النسخ لا يزال مع قمم انفجار مثل و2-8 النصوص في وقت واحد على مدى فترة المراقبة بأكملها من 60 دقيقة. تم الحصول على نتائج مماثلة لجينات المراسل EX2 و EX2-AS (البيانات غير الموضحة هنا)4. يسمح تحريض DSBs واحد في جينات المراسل (باستخدام I-SceI-GR-iRFP) بدراسة تأثير DSB على النسخ الجيني للمراسل المستمر ورصد أحداث النسخ الناشئة من موقع DSB ، وهي النسخ الناجم عن الكسر (الشكل 4B-D).
تعتمد ديناميكيات النسخ الناجم عن كسر الحمض النووي على موقع DSB داخل الجين يؤدي تحريض DSB واحد من قبل I-SceI-GR-iRFP في جين المراسل مع موقع التعرف على I-SceI المروج القريب إلى إسكات النسخ لجين المراسل بعد حوالي 11 دقيقة بعد إضافة TA ، ولا يتم استعادة النسخ خلال فترة الملاحظة البالغة 60 دقيقة (الشكل 4B). عند مراقبة النسخ الجيني لمراسل EX2 ، تم اكتشاف القمع الكامل للنسخ الكنسي الذي يحركه المروج من خلال فقدان كامل في وقت واحد لكل من إشارات MS2-GFP و PP7-RFP حوالي 30 دقيقة بعد إضافة TA. ومع ذلك ، في غضون 10 دقائق ، وإعادة تشغيل النسخ ، كما كشفت عن القمم التي تظهر من جديد PP7 - RFP الفلورسينس. يظهر الاسترداد الكامل لإشارة PP7-RFP (وليس مضان MS2-GFP) بدء النسخ الناجم عن الكسر (الشكل 4C). النسخ الناجم عن كسر ليست مستقرة على مدى فترات طويلة; يبدو انفجار مثل وانخفاض كثافة الذروة، مما يدل على أن بدأت سوى عدد قليل من النصوص الناجمة عن كسر من موقع DSB.
الجين مراسل EX2AS، الذي يحتوي على 24x PP7 الجذعية حلقة الصفيف في exon II المصب من موقع I-SceI للكشف عن النسخ الشعور، ويبين النسخ الكنسي يحركها المروج إنهاء داخل الجين مراسل EX2AS في غضون ما يقرب من 25 دقيقة بعد إضافة TA. ثم يتم استبداله النسخ المضادة للاستراحة الناجمة، كما كشفت عن تراكم البروتين MS2-GFP ملزمة للجيش الملكي النيبالي ولدت من تسلسل حلقة الجذعية MS2 antisense (الشكل 4D). كان النشاط النسخي المضاد للمنطق غائبا قبل انقطاع النسخ المنطقي بسبب تحريض DSB ويظهر في هذا المثال أن العديد من النصوص بدأت من موقع الاستراحة في غضون حوالي 15 دقيقة. وتظهر البيانات التمثيلية التي تم الحصول عليها هنا أن DSBs لها تأثيرات مختلفة على النسخ اعتمادا على موقعها داخل الجين ، كما تم الإبلاغ عنه مؤخرا4. وتكشف البيانات أيضا عن تقلب خلية إلى خلية في توقيت تحريض DSB بواسطة I-SceI-GR-iRFP، والذي يتراوح من 12 إلى 30 دقيقة بعد إضافة TA. وعلاوة على ذلك، فإن الكشف عن النصوص الفردية يسمح باكتشاف الاختلافات بين الخلية والخلية وكسر الموقع نحو كثافة النشاط النسخي الناجم عن الكسر. يتم الكشف عن النسخ الناجم عن كسر فقط في DSBs داخل الجين. وهي غائبة في DSBs المروج القريبة ، حيث يتوقف النسخ الكنسي عند DSB لفترة المراقبة المتبقية.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62968/62968fig1v2.jpg"> الشكل 1: جينات المراسل والنظام للحث على فواصل الحمض النووي المزدوج حبلا. يظهر التمثيل التخطيطي في (A) إلى (C) بنية جينات المراسلين الثلاثة المستخدمة لدراسة النسخ عند تحريض كسر حبلا مزدوج الحمض النووي. يصور الجين مراسل مع المروج القريبة I-SceI الموقع في exon الأولى (PROM) محاطة المصب من قبل 24x MS2 الجذعية حلقة (MS2-SL) صفيف تسلسل في (A). يظهر جين المراسل مع موقع I-SceI في exon الثاني (EX2) المحاط بالمصب مع تسلسل حلقة جذعية MS2 24x ومصب النهر من خلال صفيف حلقة جذعية 24x PP7 (PP7-SL) في (B). يظهر في (C) جين المراسل مع موقع I-SceI الموجود في exon II مع إدخال مضاد لالتوازي لتسلسل حلقة الجذعية MS2 24x في المنبع لموقع I-SceI للكشف عن النسخ المضاد (EX2-AS). يتم تصوير وظيفة بناء بروتين الاندماج I-SceI-GR-iRFP في (D) من خلال شاشة رسومية وصور مناظرة للخلايا الحية أدناه. عند التعبير العابر عن البناء (اللون الأحمر) في خطوط الخلايا الجينية للمراسل ، يكون البروتين سيتوبلازميا حصريا ، مما يمنع حدوث شق سابق لأوانه للموقع المستهدف بواسطة الإندونوكليز I-SceI. عند إضافة TA ، يبدأ بروتين الاندماج في الهجرة إلى نواة الخلية (المشار إليها بخط متقطع) ويبدأ في التراكم بين 5-15 دقيقة. Scalebar = 10 ميكرومتر <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62968/62968fig1v2large.jpg" target="_blank">الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62968/62968fig2v2.jpg"> الشكل 2: اختيار خلايا للتصوير ثلاثي الأبعاد الفاصل الزمني لمواقع النسخ. تظهر الصورة في (A) طبقا زجاجيا سفليا مقاس 35 مم يستخدم لتصوير الخلايا الحية ، مع غطاء معدل مخصص ، حيث تم حفر ثقب قطره 3 مم لإضافة TA المخفف في متوسط النمو مباشرة. تم وضع علامة على موقع الحفرة بدائرة حمراء. تعرض اللوحة في (B) لقطة شاشة لنافذة "Focus" لبرنامج التحكم في المجهر لإعداد وقت التعرض للعرض المباشر وإعداد التصفية وكثافة الليزر وعرض صورة المقياس على الشاشة للخلايا للتصوير اللاحق بفاصل زمني في (C) ، وهي لقطة شاشة نافذة "Capture" المقابلة لضبط جميع الإعدادات للحصول على الفاصل الزمني ثلاثي الأبعاد للخلايا الحية. يتم وصف الإعدادات المحددة لعوامل التصفية، ونوع الالتقاط، والالتقاط الزمني، وأجزاء الالتقاط ثلاثي الأبعاد في القسم 3. في المنظر الموضح هنا ، يتم تعديل الإعدادات للحصول على الفاصل الزمني ثلاثي الأبعاد لخط جين مراسل PROM المصاب مع MS2-GFP و I-SceI-GR-iRFP لبناء نسخ التصوير عند تحريض كسر مزدوج الخيط للحمض النووي في المنطقة القريبة من الجين المراسل. يتم دمج الصورة في (D) لقنوات GFP و iRFP وتظهر مجال الرؤية كما رأينا من خلال نظام المجهر ، مع العديد من خلايا خط الخلية الجينية لمراسل 293-PROM. تم دمج الخلايا مع بناء بروتين معطف MS2 dimer جنبا إلى جنب تنصهر في تسلسل التعريب النووي ، واثنين من البروتينات الفلورية الخضراء (GFP-MS2CP) ، وبناء I-SceI-GR-iRFP. تظهر العديد من الخلايا تعبيرا عن بناء GFP-MS2CP ، وبالتالي تسليط الضوء على النواة وبناء I-SceI-GR-iRFP الذي يسلط الضوء على السيتوبلازم. يشير المربع المتقطع إلى المنطقة المكبرة الموضحة في (E). بالنسبة للتصوير ثلاثي الأبعاد، يتم اختيار الخلايا وفقا للمتطلبات الممنوحة في المناقشة، مثل الخلية ذات النواة الأكبر في المنطقة المكبرة في (D). يتم تحويل هذه الخلية مع كل من بنيات الفلورسنت ويظهر موقع النسخ المسمى الزاهية (رأس السهم) عن طريق تجميع GFP-MS2CP على دي نوفو المنسوخة مراسل الجينات قبل mRNAs (الصورة اليسرى). لا يحتوي متوسط النمو للخلايا على TA؛ لذلك ، فإن بناء I-SceI-GR-iRFP هو سيتوبلازمي حصرا (الصورة اليمنى). في (F)، يتم تركيب طبق القاع الزجاجي في غرفة حضانة مرحلة المجهر لتجارب التصوير ثلاثي الأبعاد المزودة بغطاء مخصص يحتوي على ثقب تحميل TA. يتم إدخال طرف 200 ميكروبايت ميكروبايت بعناية في الحفرة لتطبيق TA المخفف على وسيط النمو في الخلايا. Scalebar = 10 ميكرومتر <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62968/62968fig2v2large.jpg" target="_blank">الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62968/62968fig3v2.jpg"> الشكل 3: برنامج اقتناء الصور وتحليلها. لوحة في (أ) يظهر لقطة شاشة من STaQTool: بقعة تتبع وكمية أداة. تعرض الصورة مثالا للسلسلة الزمنية لخط الخلية الجيني لمراسل PROM مع موقع نسخ يحمل علامة مع دائرة خضراء / مربع أبيض في عرض الإسقاط الأقصى الكثافة في الوسط. تعرض النوافذ الموجودة على الجانب الأيمن عرضا مكبرا لبقعة موقع النسخ المحددة ، ومؤامرة سطح الكثافة المظللة ثلاثية الأبعاد المقابلة مع شبكة الملاءمة الغاوسية 2D للنقطة الزمنية الحالية بالإضافة إلى مؤامرات لموقع النسخ بقعة Z موضع داخل z-stack وعرض الملاءمة الغاوسية (W) وقياس TFI بمرور الوقت. تظهر الصورة المجهرية في (B) مستوى بصري واحد مكبر لنواة خط الخلايا الجينية لمراسل PROM المصاب ب MS2-GFP. تمثل الصورة نقطة لمرة واحدة لسلسلة زمنية معايرة 2D مع 120 نقطة زمنية. تظهر النواة العديد من النصوص المسماة بالفلورسنت التي تظهر ككائنات محدودة الحيود في النيوكليوبلازم (التي تتميز بمربعات بيضاء). تعرض اللوحة اليمنى لقطة شاشة لأداة توزيع TFI وW في STaQTool لتحليل نقاط متعددة في عمليات الاستحواذ على الفاصل الزمني 2D. في هذا التحليل المثال، اكتشفت الأداة 408 بقع محدودة الحيود تمثل نصوص الجينات مراسل المسمى مع MS2-GFP التي تنتشر في النيوكليوبلازم. تعرض الرسوم البيانية الموجودة على اليمين مخططات توزيع عرض TFI وGassian المناسبة للكائنات ومنحنيات الملاءمة الغاوسية. يتم عرض قيم المتوسط TFI و W المستمدة من موضع الذروة الوسطى لمنحنى الملاءمة الغاوسية وفواصل الثقة المحسوبة في الجزء المعني. Scalebar = 10 ميكرومتر <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62968/62968fig3v2large.jpg" target="_blank">الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62968/62968fig4v2.jpg"> الشكل 4: النتائج التمثيلية للكشف عن النسخ في مواقع فواصل حبلا مزدوجة الحمض النووي. تمثل الرسوم البيانية في (A) إلى (D) منحنى TFI معايرة من موقع نسخ واحد مع مرور الوقت. يتم تحويل قيم TFI إلى نصوص باستخدام متوسط TFI من النصوص الفردية التي تقاس في تجارب المعايرة لبناء جين المراسل المعني والبروتين الرابط الحلقي الجذعي الحمض النووي الريبي الموسوم بالفلورسنت MS2 أو PP7 المستخدم في التجربة المعنية. في (A)، يظهر رسم بياني من تجربة تحكم باستخدام جين مراسل PROM بدون إضافة TA. وتشير النصوص المسماة ب MS2-GFP إلى استمرار النشاط النسخي طوال فترة المراقبة. يمثل الرسم البياني في (B) جين مراسل PROM عند إضافة TA وتحريض DSB مما يؤدي إلى قمع النسخ لوقت المراقبة المتبقي. الرسم البياني الجينات مراسل EX2 في (C) يظهر قمع النسخ من النسخ الكنسي يحركها المروج على إضافة TA. وفي وقت لاحق من نفس الفاصل الزمني، لا يظهر سوى نشاط النسخ المسمى PP7-RFP. في الرسم البياني في (D) ، يتم قمع النسخ الجيني لمراسل EX2-AS من المروج الكنسي في اتجاه المعنى بالمثل عند إضافة TA إلى جين مراسل EX2 في (C). ومع ذلك ، فإن ظهور MS2 - RFP المسمى النصوص الناشئة من المدرجة عكسي MS2 الجذعية حلقة تسلسل يشير إلى النسخ antisense غائبة خلال نشاط النسخ الشعور قبل إضافة TA. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62968/62968fig4v2large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>خط خلية المراسل</td>
			<td>EX2 و EX2-AS</td>
			<td>الحفله الراقصه</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">بلازميدات إلى ترانسفيكت</td>
			<td>1.5 ميكروغرام pI-SceI-GR-iRFP</td>
			<td>1.5 ميكروغرام pI-SceI-GR-iRFP</td>
		</tr>
<tr>
<td>0.65 ميكروغرام pUBC-mCherry-nls-tdPP7-mCherry</td>
			<td>0.5 ميكروغرام pUBC-GFP-nls-tdMS2-GFP</td>
		</tr>
<tr>
<td>0.35 ميكروغرام pUBC-GFP-nls-tdMS2-GFP</td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>الجدول 1: نقل خطوط الخلايا الجينية للمراسل. يصف الجدول مخططات العدوى وكميات البلازميدات المختلفة المستخدمة لتدوير خطوط الخلايا الجينية المراسلة المختلفة بشكل عابر.

يقدم هذا البروتوكول نظام جين مراسل جديد والإعداد التجريبي للكشف عن النسخ في فواصل حبلا مزدوجة الحمض النووي مع حساسية جزيء واحد.

DNA double-strand breaks (DSB) are the most severe type of DNA damage. Despite the catastrophic consequences on genome integrity, it remains so far ...

يسمح هذا البروتوكول بمراقبة واكتشاف أحداث النسخ ويعطي رؤى حول آثار فواصل حبلا مزدوجة الحمض النووي على النسخ المستمر للجين. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي مراقبة نصوص الحمض النووي الريبي المسماة بشكل فردي في خلايا واحدة على فترات زمنية من الثواني على مدى فترة إجمالية قدرها ساعة واحدة أو أكثر. توفر هذه الطريقة نظرة ثاقبة على استجابة تلف الحمض النووي للتحقيق في الحديث المتبادل بين النسخ والعمليات الخلوية ، مثل تكرار الحمض النووي وآفات الحمض النووي.نصيحتنا هي مراقبة الخلايا باستخدام الدوكسيسيكلين وإجراء قياسات المعايرة لتدريب الكشف عن موقع النسخ وجزيئات الحمض النووي الريبي المسمى. في أنبوب 1.5 ملليلتر من أجهزة الطرد المركزي الدقيق، قم بإعداد الحل A الذي يحتوي على 150 ميكرولتر من الحمض النووي البلازما MEM المخفض في المصل و2.5 ميكروغرام لكل ميكرولتر من الحمض النووي في كاشف مساعد العدوى. وبالتوازي مع ذلك، قم بإعداد المحلول B الذي يحتوي على 150 ميكرولتر من MEM المصلي المخفض و1.5 ميكروغرام لكل ميكرولتر من الحمض النووي في كاشف إصابة قائم على الدهون.احتضان كلا الحلين في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق، ثم إضافة الحل بلطف A إلى الحل B واحتضان لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. لتضمين الخلايا، أضف 300 ميكرولتر من الحلول المختلطة A وB إلى كل طبق واوزعه برفق. تخزين طبق أسفل الزجاج داخل طبق 100 ملليمتر ثقافة الخلية القياسية واحتضانه في 37 درجة مئوية في جو رطب مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون.إعداد أنبوب 1.5 ملليلتر من أجهزة الطرد المركزي الدقيق مع 200 ميكرولتر من DMEM مع HEPES دون فينول الأحمر وتكمل مع 10٪ مصل البقر الجنيني جردت الفحم، ثم إضافة TA. ما يقرب من ساعة واحدة قبل بدء المراقبة المجهرية، والحث على نسخ الجينات مراسل عن طريق إضافة doxycycline إلى متوسط النمو ومزيج بلطف عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا مع 200 ميكروليتر micropipette. نقل الخلايا إلى المجهر 30 دقيقة على الأقل قبل بدء الملاحظة ووضع طبق 100 ملليمتر مع الخلايا داخل غرفة حضانة المجهر الكبيرة المسخنة. ضع أنبوب الطرد المركزي الدقيق مع TA المخفف مسبقا داخل غرفة المجهر البيئية الكبيرة لتدفئته إلى 37 درجة مئوية.استبدل غطاء الطبق السفلي الزجاجي بغطاء يحتوي على ثقب قطره ثلاثة ملليمترات. حدد هدف الغمر 100X النفط في لوحة التحكم المجهر وتطبيق قطرة من زيت الغمر إلى الهدف. ضبط طبق القاع الزجاجي مع الخلايا داخل غرفة حضانة مرحلة المجهر وقفل في مكانه، ثم إغلاق غطاء حاضنة المرحلة وجميع أبواب السكن المجهر.بدء تشغيل المجهر والتحكم في البرامج، وفتح نافذة التحكم التركيز وانقر على جزء النطاق. في جزء تحديد الانبعاثات، انقر فوق مربع العين بنسبة 100٪ لتعيين مسار شعاع العين لمراقبة العين مباشرة بالعين. في قائمة مجموعة عوامل التصفية، قم بالتبديل إلى مجموعة فلتر العين وانقر فوق برايتفيلد، ثم اضغط على زر برايتفيلد المفتوح.حرك هدف المجهر نحو طبق القاع الزجاجي حتى يلمس الزيت الزجاج. ننظر من خلال العين والتركيز يدويا على مستوى الخلايا، ثم إيقاف تشغيل زر برايتفيلد مفتوحة. اترك الخلايا لمدة 30 دقيقة قبل بدء عمليات المراقبة التجريبية للسماح لها بالتكيف مع الظروف البيئية ومنع الانجراف البؤري أثناء التصوير بسبب تدرجات درجة الحرارة.إعداد 200 ميكرولتر micropipette و 200 نصائح مرشح ميكرولتر في درجة حرارة الغرفة. في إطار التحكم البؤري لبرنامج التحكم بالمجهر، قم بتعيين كثافة الليزر إلى 5٪ وأدخل قيمة 50 مللي ثانية لوقت التعرض. افتح نافذة الالتقاط لضبط الإعدادات لتنفيذ عملية اقتناء تلقائي للصورة للوقت ثلاثي الأبعاد.حدد نوع اكتساب الالتقاط ثلاثي الأبعاد وحدد 12 إلى 16 شريحة بصرية مفصولة ب 0.4 ميكرومتر. حدد خانات الاختيار الخاصة بالنطاق حول التيار وارجع إلى الوضع الحالي بعد الالتقاط. في جزء التقاط الفاصل الزمني، أدخل قيمة 120 لعدد النقاط الزمنية و30 ثانية للفاصل الزمني.حدد مرشح الكونفوجال المحدد وفقا لتسميات البروتين الفلورية المنقوزة كما هو مذكور في مخطوطة النص وحدد وقت التعرض لكل قناة إلى 50 مللي ثانية. استخدم الإعداد الحالي لطاقة الليزر لاستخدام قيمة 5٪ المحددة في إطار التركيز البؤري. في إطار التحكم في التركيز، انتقل إلى جزء الكاميرا، وحدد عنصر التحكم في عرض صورة المقياس واختر الزر اليدوي لإعداد نطاق ثابت من شدة الصورة ليتم عرضها.حدد الخلايا للتصوير الفاصل الزمني ثلاثي الأبعاد لمواقع النسخ عند تحريض فاصل حبلا مزدوج الحمض النووي. قم بفحص الخلايا وحدد ثلاثة حقول للعرض وفقا للشروط الموضحة في مناقشة النص. التركيز على كل خلية مختارة موجودة سابقا في وسط مجال الرؤية مع موقع النسخ في المستوى الأوسط من المكدس Z.وضع علامة على كل موضع XYZ في مستوى XY من إطار التحكم في التركيز بالنقر فوق نقطة تعيين. إضافة 200 ميكرولتر من TA المخففة مسبقا إلى الخلايا وبدء التصوير سلسلة زمنية 3D عن طريق النقر على البدء على نافذة الالتقاط. حفظ بيانات التصوير في تنسيق بيانات برنامج التحكم بالمجهر على القرص الصلب للكمبيوتر التحكم بالمجهر.إضافة 0.5 ميكروغرام لكل ملليلتر من دوكسيسيكلين إلى متوسط النمو للخلايا ساعة واحدة قبل البدء في اكتساب صورة المجهر. جبل طبق أسفل الزجاج داخل غرفة الحضانة مرحلة المجهر وإعداد الحصول على الصورة كما هو موضح سابقا. استخدم نفس إعدادات كثافة الليزر والتعرض كما كان من قبل.تعيين إعدادات التقاط سلسلة زمنية 2D وتعيين 120 نقطة زمنية على فترات من 500 مللي ثانية في لوحة التقاط الفاصل الزمني. الحصول على العشرات من سلسلة زمنية المعايرة من مواقع متعددة من أجل توليد مجموعات البيانات لحساب عدة مئات من القياسات TFI نسخة واحدة. باستخدام هذا البروتوكول، يتم الحصول على رسم بياني يعرض عدد النصوص الجينية للمراسل ذات العلامات الفلورية بمرور الوقت بدقة زمنية تبلغ ثوان على مدى فترات تصل إلى ساعات.يظهر هنا المسار الزمني لقيم TFI لموقع نسخ الجينات لمراسل PROM المسمى بتراكم بروتين معطف MS2 المسمى بجزيئات البروتين الفلوري الأخضر على النصوص الوليدة. إن تحريض DSB واحد في جينات المراسل يجعل من الممكن دراسة تأثيره على النسخ الجيني المستمر للمراسل ورصد أحداث النسخ الناشئة من موقع DSB ، وهي النسخ الناجم عن الكسر. TA إضافة وتعريف DSB يؤدي إلى قمع النسخ الجيني مراسل PROM بعد حوالي 11 دقيقة التي لم يتم استعادتها حتى 60 دقيقة.يظهر الاسترداد الكامل لإشارة PP7-RFP بدء النسخ الناجم عن الكسر. يظهر جين المراسل المضاد للمنطق EXON 2 إنهاء النسخ المدفوعة بالمروج ، والذي يتم استبداله بعد ذلك بنسخ مستحث من قبل antisense break-induced كما كشف عن تراكم بروتين معطف MS2 المسمى بربط بروتين فلوري أحمر إلى الحمض النووي الريبي المتولد من تسلسل الحلقة الجذعية MS2 المضادة للمنطق. اختيار الخلايا للتصوير، وإعداد التصوير الفاصل الزمني المعالجة ضبط موقف Z من موقع النسخ المسمى على كل موقف XY في وسط المكدس Z ليتم الحصول عليها.وأخيرا، يجب تنفيذ إضافة TA المخفف في متوسط النمو بعناية فائقة لمنع أي تحولات في المواقف المختارة مسبقا مع الخلايا التي سيتم تصويرها. يمكن تطبيق تصوير نسخ الحمض النووي الريبي المفردة في 3D مع مرور الوقت في الخلايا الحية لدراسة نسخ الحمض النووي الريبي أثناء تكرار الحمض النووي أو تغييرات النسخ أثناء تطور دورة الخلية.

live-cell-imaging-transcriptional-activity-at-dna-double-strand

Research

JoVE Journal

Biology

علم الأحياء

توضح هذه المقالة GFP المستندة...

تحليل مزدوج الجديلة إصلاح الحمض النووي (DSB) فاصل في خلايا الثدييات

يصف هذا البروتوكول طريقة لتصور على الحمض النووي المزدوج حبلا البروتين كسر إشارة تنشيط ردا على الحمض النووي من التلف وكذلك التوطين خلال الانقسام.

عامين والتصوير الثلاثي الابعاد لايف خلية من البروتينات DNA الاستجابة الأضرار

في هذا الفيديو ، نصف تقنية الفحص المجهري المناعي الفلوري للكشف عن بروتينات استجابة تلف الحمض النووي المحددة في مواقع فواصل الحمض النووي المزدوجة في الخلايا البشرية أحادية النواة. يتم التعرف على البروتينات بواسطة أجسام مضادة أولية محددة ، والتي بدورها ترتبط بالأجسام المضادة الثانوية الموسومة بالفلوروفور والتي تتألق أثناء التصور المجهري ، مما يتيح تصور البروتينات كبؤر فلورية مميزة داخل نوى الخلية.

الفحص المجهري المناعي الفلوري لتحليل فواصل الحمض النووي المزدوجة

الأسفار [كنفوكل] مجهرية والليزر أدوات العرض الجزئي-التشعيع لإحداث ضرر الحمض النووي، ورصد الاستجابة للبروتينات إصلاح الحمض النووي في المجالات النووية الفرعي المحدد. هذا الأسلوب قد دفعة قوية لمعرفتنا بالكشف عن الأضرار، والإشارات، والتوظيف. هذه المخطوطة يوضح هذه التكنولوجيات لدراسة إصلاح كسر حبلا مفردة ومزدوجة.

تطبيق الليزر الجزئي-التشعيع لدراسة واحدة ومزدوجة حبلا كسر إصلاح في خلايا الثدييات

دراسة حركية إصلاح تلف الحمض النووي يتطلب نظاما للحث على الآفات في المناطق شبه نووية محددة. يصف لنا طريقة لإنشاء فواصل مزدوجة-الذين تقطعت بهم السبل المترجمة استخدام مجهر [كنفوكل] المسح الضوئي الليزر مزودة بليزر 405 نانومتر وتوفير إجراءات التشغيل الآلي التحديد الكمي للقوى المحركة لعوامل الإصلاح في هذه الآفات.

التحقيق في تجنيد البروتين للحمض النووي آفات استخدام الليزر 405 نانومتر الصغرى-التشعيع

إصلاح فواصل مزدوجة-حبلا الحمض النووي عملية دينامية، تتطلب ليس فقط تشكيل مجمعات إصلاح فواصل، ولكن أيضا على القرار بعد معالجة الآفة. هنا، نستخدم مجهرية الفلورة لفواصل مزدوجة-الذين تقطعت بهم السبل عابرة وطويلة الأمد كأداة لتشريح هذه الآلية صيانة الجينوم.

وصف عمليات إصلاح الحمض النووي في فواصل الحمض النووي عابرة وطويلة الأمد مزدوجة-حبلا مجهر الفلورة

بعد تلف الحمض النووي، تقوم الخلايا البشرية بتنشيط مسارات الإصلاح الأساسية لاستعادة سلامة جينومها. هنا، نحن وصف طريقة من المناعة غير المباشرةflufluorescence كوسيلة للكشف عن البروتينات إصلاح الحمض النووي، وتحليل توظيفها المكانية والزمانية، والمساعدة في استجواب التفاعل البروتين البروتيني في مواقع الضرر الحمض النووي.

التصور من الحمض النووي إصلاح البروتينات التفاعل من قبل immunofluorescence

تقدم هذه المقالة الخطوات الأساسية لتثبيط المناعة والكروماتين المناعي. وتستخدم هذه البروتوكولات عادة لدراسة العمليات الخلوية المرتبطة بتلف الحمض النووي ولتصور وقياس تجنيد البروتينات المتورطة في إصلاح الحمض النووي.

تصور وقياس الأضرار التي لحقت بالحمض النووي الخاصة بالموقع القائم على الإندونوكليز

في البروتوكول الحالي ، نوضح كيفية تصور استئصال نهاية الحمض النووي المزدوج خلال مرحلة S / G2 من دورة الخلية باستخدام طريقة قائمة على التألق المناعي.

تقييم استئصال نهاية الحمض النووي المزدوج العالمي باستخدام وسم الحمض النووي BrdU إلى جانب تصوير تمييز دورة الخلية

يقدم البروتوكول التالي الكشف عن بؤر الحمض النووي التي تقطعت بها السبل في المرحلة G1 من دورة الخلية باستخدام مزامنة دورة الخلية متبوعة بتلطيخ RPA2 المناعي.

تصور بؤر الحمض النووي المفردة التي تقطعت بها السبل في المرحلة G1 من دورة الخلية

نقدم بروتوكولات لتقييم كفاءة مسار إصلاح كسر الشريط المزدوج في الخلايا باستخدام مجموعة من ركائز مراسل خارج الكروموسومات القائمة على التلألؤ.

تقييم نشاط إصلاح كسر الحمض النووي المزدوج باستخدام فحوصات المراسلين عالية الإنتاجية والكمية القائمة على التلألؤ

اكتشف طريقة تصوير الخلايا الحية لرصد النشاط النسخي عند فواصل الحمض النووي مزدوجة السلسلة باستخدام مجهر الفلورة. تتيح هذه التقنية مراقبة جزيئات الرنا الفردية بدقة زمنية تصل إلى ثوانٍ لفهم استجابة الخلايا للضرر الجيني.

تصوير الخلايا الحية للنشاط النسخي في فواصل الحمض النووي مزدوجة ستراند

استكشف المزيد من الفيديوهات