في الجسم الحي تصوير الكالسيوم لاستجابة الخلايا العصبية للعقد الجذرية الظهرية للمنبهات الجسدية والحشوية

تركز أبحاثنا على الخلايا العصبية ودوائر الجهاز الحسي الجسدي المشاركة في سرد التأثيرات المسكنة للوخز بالإبر على الألم الحشوي أثناء محاولة ضبط استجابات الخلايا العصبية ل DRG العصبية لمحفزات الوخز بالإبر. لا يمكن للطرق التقليدية ، مثل التسجيل الكهربائي ، فحص أعداد الخلايا الكافية والروابط الخلوية المحددة بكفاءة لتحديد الخلايا العصبية الحشوية أو الجسدية المستجيبة في الجسم الحي. كانت دراسة الأدوار الوظيفية للخلايا العصبية DRG في التأثير المسكن للوخز بالإبر صعبة بسبب القيود التكنولوجية.

قدمنا نهجا عاما لمراقبة مسؤولية الخلايا العصبية DRG رقم ستة على محاكاة القولون والوخز بالإبر في الجسم الحي. يحدد البروتوكول إجراءات مراقبة نشاط الخلايا العصبية DRG في الجسم الحي استجابة للمدخلات الجسدية والأحشاء. يعد هذا تحسنا مقارنة بالدراسة السابقة ، والتي ركزت فقط على مسح استجابات الخلايا العصبية في L5 DRG تحت المحفزات الجسدية.

في المستقبل ، مع الإعداد الصحيح ، يمكن إجراء تصوير DRG in vivo CAS في أجزاء الصدر أو عنق الرحم ، مما يوفر أداة أكثر قوة لدراسة آثار الألم الحشوي والوخز بالإبر. هذه الطريقة ضرورية لباحثي الوخز بالإبر للتعلم. للبدء ، ضع الفأر المجلي في وضع الانبطاح على وسادة التدفئة.

قم بعمل شق خط الوسط بطول سبعة سنتيمترات في أسفل الظهر وقم بتمديده من أسفل الظهر الخامس إلى الفقرات العجزية الأولى. بعد ذلك ، حرك بعناية عضلات Longissimus lumborum جانبا لفضح العمليات الشائكة للفقرات الثلاث. حرك الأجزاء الداخلية من طول الظهر القطني الثنائي ، وعضلات العمود الفقري القطني الظهري ، وعضلات نصف العمود الفقري القطني الظهرية لفضح العمليات المفصلية والثديية الثلاث المتتالية مع جزء التسجيل في منتصف الفقرات.

الآن ، قم بتثبيت بشكل آمن باستخدام ملقط الأسنان على العمليات المفصلية الثنائية للفقرات المجاورة. استخدم ملقط rongeur لإزالة العمليات المفصلية والثديية اليسرى أو اليمنى للفقرات القطنية الأربع أو الستة. قم بتعريض أسفل الظهر الأيسر أو الأيمن بعناية بعد إزالة الأنسجة الضامة فوقه.

تأكد من الحفاظ على epineurium سليما على الجانب المختار من الفقرات القطنية الست. قم بتغطية مناطق DRG المكشوفة بكرات قطنية صغيرة مبللة بمحلول ملحي للحفاظ على الحالة النشطة. الآن ، قم بتوصيل نظام توصيل التخدير منخفض التدفق بقنية القصبة الهوائية لتنبيب الفئران.

ضع مع DRG المكشوف على وسادة تسخين موجودة على مسرح مشبك العمود الفقري المخصص. باستخدام مشابك على العمود الفقري للفقرات المجاورة ، قم بتأمين لتقليل الحركة أثناء الاختبار. بعد ذلك ، استبدل كرات القطن المبللة بالمحلول الملحي حتى تصبح منطقة الجراحة نظيفة بشكل كاف.

أدخل المشبك الشوكي المخصص في مرحلة المجهر المصممة خصيصا. للتصوير ، ضع عدسة موضوعية هوائية طويلة المدى من مجهر متحد البؤر فوق DRG المكشوف. التقط مكدسات Z ذات المنقضي الزمني لأسفل الظهر السليم أربعة أو ستة DRG بدقة 25 ميكرومتر لكل خطوة ودقة 512 × 512 أو 1 ، 024 × 1 ، 024 بكسل.

قم بإجراء مسح XYZT ل DRG بأربعة إلى ثمانية مداخن ، بما في ذلك حالة إلى ثلاث حالات أساسية ، واثنين إلى ثلاثة محفزات للوخز بالإبر أو انتفاخ القولون والمستقيم الحشوي ، وحالة إلى حالتين بعد التحفيز. بعد ذلك ، قم بتطبيق محفزات التنظيف بالفرشاة أو القرص على أسفل ظهر أو الطرف الخلفي أو مخلبه الخلفي لتقييم المجال الأكثر حساسية للخلايا العصبية DRG المصورة. قم بإدارة محفزات الوخز بالإبر يدويا أو باستخدام محفز الوخز بالإبر والأعصاب المتاحين تجاريا.

استخدم انتفاخ القولون والمستقيم باستخدام مقياس ضغط الهواء عصامي الصنع للحث على المحفزات الحشوية. باستخدام المجهر متحد البؤر ، قم بقياس الزيادة في التألق الأخضر للخلية GCaMP العصبية عند الارتباط بالكالسيوم داخل الخلايا بعد المحفزات الجسدية أو الحشوية. باستخدام برنامج التصوير ، قم بتفتيح الفيديو باستخدام خيار اللون.

حدد الخلايا المرئية يدويا وتأكد من حجم الخلية وشدة التألق النسبية. عبر عن شدة التألق كنسبة من الزيادة في الحد الأقصى للتألق المستحث إلى المستوى القاعدي. تفتقر الخلايا العصبية الستة DRG القطنية عموما إلى مضان GFP الأساسي ، وربما تتأثر بمستويات تعبير GCaMP والأضرار الجراحية.

تسببت محفزات انتفاخ القولون والمستقيم في زيادة سريعة وعابرة في مضان GCaMP. لوحظت استجابات مماثلة مع تطبيق الوخز بالإبر الكهربائية BL25. أظهرت الخرائط الحرارية والمخططات الخطية استجابات جميع الخلايا العصبية المحاطة بدائرة لانتفاخ القولون والمستقيم والوخز بالإبر الكهربائية BL25.

يوضح الرسم البياني أقطار الخلايا العصبية المستجيبة لانتفاخ القولون والمستقيم والوخز بالإبر الكهربائية BL25.