العدوى في الجسم الحي والمختبري لجذور البطاطس بالديدان الخيطية الطفيلية النباتية لتقييم التغيرات الهيكلية المستحثة

يصف البروتوكول إصابة جذور Solanum tuberosum بالديدان الخيطية الطفيلية النباتية في ظروف الدفيئة في الجسم الحي وجذور البطاطس المعدلة وراثيا في المختبر للتحليل الكيميائي النسيجي لبنية الجذر من خلال الفحص المجهري البصري.

تتأثر الأبحاث حول عدوى الديدان الخيطية الطفيلية في المحاصيل بتباين الظروف البيئية ، والتي يمكن أن تؤثر بشكل كبير على النتائج التجريبية وقابلية تكرار البيانات.

لقد قمنا بتطوير مزارع في المختبر لجذور البطاطس المعدلة وراثيا مع الديدان الخيطية الطفيلية النباتية كبديل موثوق به يشغل مساحة أقل ، ويتطلب وقتا أقل للحصول عليه ، وخالي من التلوث أو من التباين الجيني المضيف.

لا يزال تتبع التطور الزمني لعدوى الديدان الخيطية في جذور المحاصيل أمرا صعبا. توفر تقنيات التلوين التفاضلي طريقة موثوقة لتحديد مواقع العدوى والتمييز بين مراحل حياة الديدان الخيطية بدقة.

بالمقارنة مع تجارب الدفيئة ، تدعم جذور البطاطس الثقيلة نظاما مستمرا ومراقبا لتوفير جميع مراحل تطور الديدان الخيطية ، بغض النظر عن التغيرات الموسمية أو المناخية.

لذا فإن البروتوكول الموصوف يقدم العديد من التطبيقات المستقبلية الواعدة. على سبيل المثال ، يتيح إجراء دراسات مفصلة حول الآليات الجزيئية والخلوية لتقديم رؤى حول كيفية إصابة الديدان الخيطية الطفيلية النباتية بالعوائف والتلاعب بها.

[الراوي] للبدء ، اغسل الجزرة تحت ماء الصنبور الجاري ثم بمحلول منظف شائع لإزالة الحطام. بمجرد تجفيفها بمنشفة ورقية ، أدخل سيخا معدنيا معقما في الجزء العلوي من الجزرة ، حوالي سنتيمتر إلى سنتيمترين للداخل. باستخدام زجاجة غسيل مزودة بفوهة ، بلل الجزر بنسبة 96٪ من الإيثانول. امسح الطرف السفلي من الجزر على ورق ترشيح معقم. ثم مررها بعناية عبر اللهب. باستخدام مقشرة معقمة ، قشر الجزر من أعلى إلى أسفل وكرر الاشتعال. بعد التخلص من القسمين العلوي والسفلي ، ضع القسم الأوسط في طبق بتري معقم. باستخدام شفرة معقمة وملاقط ، قم بقطع أقسام بسمك سنتيمتر واحد. انقل الأقسام إلى أطباق بتري معقمة. بعد إغلاق اللوحة ، احتفظ بها تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية لمدة 60 دقيقة على كل جانب لتعقيم أقراص الجزر. احتضان أقراص الجزر عند 25 درجة مئوية في الظلام لمدة أسبوع إلى أسبوعين. بعد ذلك ، باستخدام شفرة معقمة ، قم بعمل شق على شكل X في وسط قرص الجزر ، مع قطع منتصف العمق فقط. ماصة 50 ميكرولتر من تعليق الديدان الخيطية لآفة الجذر تحتوي على 50 مرحلة حياة مختلطة على الأقل في الشق. بعد إغلاق طبق بتري ، احتضنه عند 25 درجة مئوية في الظلام لمدة تصل إلى ثلاثة أشهر. لاستخراج الديدان الخيطية لآفة الجذر ، انقل أقراص الجزر ذات النخر المرئي إلى منخل شبكي 75 ميكرومتر بقطر ثمانية سنتيمترات يوضع في وعاء زجاجي معقم. بعد ذلك ، اسكب محلول المضادات الحيوية على المنخل حتى يتم تغطية الأقراص. بعد الحضانة طوال الليل في الظلام ، استخدم ماصة معقمة لنقل الديدان الخيطية من قاع الوعاء إلى كتلة تلطيخ زجاجية معقمة. ضع ماصة ملليلتر واحد من محلول المضادات الحيوية في كتلة التلوين واترك الديدان الخيطية تستقر لمدة 30 إلى 40 دقيقة. قم بإخراج محلول المضادات الحيوية المستخدم وكرر عملية الغسيل من أربع إلى خمس مرات. استخدم تعليق الديدان الخيطية لآفة الجذر على الفور ، أو قم بتخزينه على حرارة 11 درجة مئوية. حدد درنات البطاطس من نفس الحجم وتخلص من أي منها بها ثقوب أو كدمات أو أقسام ناعمة. املأ الأواني سعة خمسة لترات بمزيج واحد لواحد من تربة الأوتوكلاف والرمل واخلط 22.5 جراما من سماد NPK بطيء الإطلاق. ثم زرع البطاطس على عمق تسعة سنتيمترات تحت سطح التربة. ضع الأواني في دفيئة تحت رطوبة 50 إلى 70٪. اسق الماء بشكل متكرر للحفاظ على رطوبة التربة عند 70٪ من الحد الأقصى لسعة الاحتفاظ بالمياه ، وتجنب درجات الحرارة القصوى. بمجرد ظهور نباتات البطاطس ، قم بإنشاء أربعة إلى ستة ثقوب موزعة بالتساوي حول كل نبات لمعرفة العمق. ماصة ثمانية ملليلتر من المعلق تحتوي على 30,000 ديدان خيطية جذرية في مرحلة الحياة المختلطة في الثقوب. ثم قم بتغطية الثقوب بخليط التربة. بالنسبة للأواني والأواني التي تحتوي على الديدان الخيطية لآفة الجذر ، امتنع عن الري في يوم التلقيح. بعد شهرين من الثقافة ، اقتلع نباتات البطاطس وافصل البراعم والجذور للوزن. اغسل نظام الجذر بعناية. افحص جذور مواقع هجوم RLN باستخدام تقنيات التلوين المناسبة. ضع درنات البطاطس المغسولة والمعقمة في وعاء. قم بتغطية الدرنات بمحلول مبيض تجاري بنسبة 25٪. أغلق الوعاء واخلطه لمدة 15 دقيقة. بمجرد التخلص من المبيض ، اشطف الدرنات ثلاث مرات بماء الصنبور المعقم. بعد ذلك ، في غطاء التدفق ، اغمر الدرنات في محلول إيثانول بنسبة 80٪ لمدة 15 دقيقة مع تحريض قوي. بعد سحب الإيثانول ، اشطفه ثلاث مرات بماء الصنبور المعقم. باستخدام مشرط معقم ، قم بإزالة الأجزاء الطرفية من الدرنات. قسم القطعة المركزية الداخلية إلى شرائح بسمك 0.5 سم. لتلقيح الأقسام ، قم أولا بخلط ملليلتر واحد من تعليق Rhizobium rhizogenes مع تسعة ملليلتر من وسط SH. اغمس طرف مشرط معقم في المعلق المخفف وجرح سطح شرائح البطاطس خمس مرات. بمجرد تجفيف الأجزاء ، ضعها على وسط SH شبه صلب واحتضانها عند 25 درجة مئوية لمدة ثلاثة أيام في الظلام لتسهيل تعداء البلازميد. في نهاية اليوم الثالث ، قم بنقل الأجزاء المصابة إلى أطباق تحتوي على وسط SH شبه صلب مكمل بالمضادات الحيوية. بعد ثلاثة أشهر ، استخدم ملاقط معقمة لجمع مجموعة جرام واحد من الجذور المعدلة وراثيا. انقل الجذور إلى منتصف الطبق باستخدام وسط SH طازج شبه صلب وخالي من المضادات الحيوية. لجمع كتل بيض الديدان الخيطية ، احصل على كرات الجذر. استخدم زوجا من الملقط المعقم فائق الدقة لاستخراج كتل البيض بعناية تحت مجهر استريو مجهر مضبوطة على تكبير 20 ضعفا. ضع كتل البيض في طبق بتري مغطى يحتوي على خمسة ملليلتر من ماء الصنبور المعقم واتركها تفقس لمدة 48 ساعة. بعد ذلك ، في غطاء التدفق ، قم بتعبئة خمسة ملليلتر من نظام التعليق J2 الذي يحتوي على 100 ديدان خيطية لكل مليلتر على منخل شبكي 20 ميكرومتر. بعد الغسيل بماء الصنبور المعقم ، اغمر النصف السفلي من المنخل الذي يحتوي على الديدان الخيطية J2 في محلول بيروكسيد الهيدروجين بنسبة 20٪ ، واخلطه بحركة دائرية لمدة 15 دقيقة. قم بتوزيع ماء الصنبور المعقم من خلال المنخل فوق الديدان الخيطية ، وكرر عملية الغسيل مرتين. قم بإمالة المنخل بحيث تتجمع الديدان الخيطية عند الحدود أثناء الغسيل النهائي. بعد ذلك ، قم بسحب مرقة واحدة من الماء المعقم فائق النقاء من حدود الغربال لاستعادة الديدان الخيطية. في غطاء التدفق ، قم بزراعة كتلة بوزن جرام واحد من جذور البطاطس المعدلة وراثيا على ألواح SH مع 100 ديدان خيطية معقمة. راقب الزراعة المشتركة بانتظام تحت المجهر المقلوب بتكبير 100 ×. عندما تصبح كتل البيض مرئية ، قم بزراعة الجذور إلى طبق متوسط SH جديد. أدى استخدام أقراص الجزر إلى زيادة متوسطة 100 مرة في أعداد الديدان الخيطية في غضون ثلاثة أشهر. لم تظهر نباتات البطاطس أي أعراض مرئية تحت انخفاض أعداد الديدان الخيطية لآفة الجذور. لوحظت عدة مراحل حياة من Pratylenchus penetrans في قشرة الجذر بعد تلطيخها بحمض الفوشين ، مما يشير إلى تغلغل الأنسجة والآفات النخرية المرتبطة بها كانت مرئية بوضوح في المناطق المصابة. أظهر تطور جذور البطاطس المعدلة وراثيا نموا أوليا لكتلة الخلية على طول الجروح الناجمة عن المشرط في قسم درنات البطاطس ، تلاه ظهور جذور معدلة وراثيا. لوحظ نمو مستدام للجذور في وسط الاستزراع وتم نقل كتل الجذور بنجاح إلى وسط الاستزراع الطازج لاستمرار النمو. أصيبت مزارع الجذور المعدلة وراثيا للبطاطس بنجاح بالأحداث في المرحلة الثانية من Meloidogyne chitwoodi لإنشاء مزارع مشتركة للديدان الخيطية النباتية. لوحظت كرات الجذر التي تحتوي على إناث بالغات وكتل بيض في الثقافات المصابة. كانت أنسجة المرارة التي تشكلت بواسطة Meloidogyne chitwoodi مرئية بعد إصابة جذور البطاطس المعدلة وراثيا بمراحل متميزة من تطور الديدان الخيطية والتكاثر يمكن تحديدها ، بما في ذلك تكوين كتل البيض والبيض.